[发明专利]一种采用乳酸链球菌素提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA的方法

说明书

本发明公开了一种采用乳酸链球菌素提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA的方法，本发明公开的针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的核酸提取方法，首次提出利用乳酸链球菌素Nisin对MRSA进行裂解，即对培养后的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌采用乳酸链球菌素进行孵育处理，再使用常规的DNA提取操作，例如利用现成的市售试剂盒进行基因组DNA提取，实验数据显示，经Nisin提前预处理后，可以显著提高MRSA的基因组DNA提取效率。本发明方法提取的基因组DNA纯度高、浓度大，能满足特定基因的鉴定和测序等研究的要求，而且省时高效，成本低，操作简单。

技术领域

本发明属于微生物基因组提取技术领域，具体涉及一种采用乳酸链球菌素提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA的方法。

背景技术

需氧革兰阳性球菌是细菌性感染的重要病原菌，其中包括葡萄球菌属、肺炎链球菌、溶血性链球菌、草绿色链球菌等链球菌属、肠球菌属等细菌，且感染率逐年增加，约占全部细菌感染的40％。在医院获得性血流感染中，凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和肠球菌分别居前三。近年来革兰阳性球菌耐药性的日趋严重，特别是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌MRSA。无论是用于致病微生物检测的分子诊断技术，还是用于细菌分子生物学研究的转录组研究技术，其第一步就是模板核酸的制备，即样品中核酸(包括RNA和DNA)的提取，这直接影响着这些检测技术的结果。金黄色葡萄球菌为革兰阳性细菌，细胞壁较厚难于破裂，90％以上金黄色葡萄球菌含有葡萄球菌蛋白A；有些金黄色葡萄球菌本身还分泌一种耐热耐核酸酶的蛋白质可以降解核酸，因此在其核酸提取方面，效果一直不很理想。

目前，革兰氏阳性菌的核酸提取主要采用裂解细胞后提取核酸的方法，其中常用机械破碎法和酶裂解法破坏细菌的细胞壁。机械破碎法如玻璃珠法、超声破碎等，其局限性在于需要额外的设备且破碎过程剧烈，可能造成基因组DNA的物理性断裂。酶裂解法则较为温和，溶菌酶(Lysozyme)是实验室最常用的用于提取革兰阳性细菌核酸的细胞壁水解酶，主要水解连接G+细菌细胞壁的N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4-糖苷键。但是，由于金黄色葡萄球菌含有葡萄球菌蛋白A，与细胞壁中的肽聚糖共价交联，对溶菌酶的处理不敏感，因此裂解效果不明显。

由于MRSA基因组DNA的提取难度较大，目前市面上还有一种溶葡球菌酶(Lysostaphin)产品。溶葡球菌酶是一种肽链内切酶，其作用机制是裂解葡萄球菌细胞壁肽聚糖中的甘氨酸五肽交联桥，进而破坏细胞壁的完整性并溶解菌体，提高金葡菌基因组DNA的提取率。但溶葡球菌酶有两方面的局限性，一方面，已有研究报道由于细菌细胞壁的肽聚糖交联桥的结构改变，出现了对该酶抗性的金黄色葡萄球菌株。另一方面溶葡球菌酶售价较高(600-800元/mg，单次提取约花费3-4元)。这些试剂盒的价格昂贵，操作步骤繁琐，并且提取效果也并不理想。因此，如何从MRSA中高效、快捷的提取核酸，已成为了目前分子诊断技术和转录组研究等技术推广和应用的一个瓶颈。

乳酸链球菌素(nisin)是一种细菌肽，由乳球菌属和链球菌属的一组革兰氏阳性菌所产生，可作用于细菌的细胞壁、细胞膜，表现出对细胞壁、细胞膜的破坏作用，抑制引起食品腐败和人体感染的绝大多数革兰氏阳性菌。目前，nisin主要应用于食品防腐以及抑菌研究，还没有研究人员对Nisin作为革兰氏阳性病原菌的核酸提取试剂进行过研究报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种采用乳酸链球菌素提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA的方法，能够解决现有的提取方法所用酶易产生耐药且价格高昂、提取操作复杂导致提取效率不高的技术问题。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开的一种采用乳酸链球菌素提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA的方法，包括以下步骤：

1)在培养耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的液体培养基中加入乳酸链球菌素，进行孵育，离心去除上清，收集菌体沉淀；