[发明专利]一种重组琼胶酶及其基因和应用

说明书

一种重组琼胶酶及其基因和应用，所述重组琼胶酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。所述重组琼胶酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。还提供了所述的重组琼胶酶在制备琼胶寡糖上的应用。

技术领域

本发明涉及琼胶酶及其编码基因及应用。

背景技术

大型海藻多糖——琼胶(agar)是红藻细胞壁的主要成分，琼胶由琼脂糖和琼脂胶两部分组成，其中琼脂糖是由(1-3)-O-β-D-半乳糖和(1-4)-O-3,6-内醚-α-L-半乳糖交替组成的线形链状分子，琼脂胶成分较复杂，主要由长短不一的半乳糖残基的多糖链组成，其降解产物琼胶寡糖(agaro-oligosaccharide，AOS)具有抑菌、抗病毒、增值肠道益生菌、抗肿瘤、提高机体免疫力、抗炎、抗氧化、清除羟基自由基、保湿和美白等多种特殊的生物学活性，从而使其在医药、食品、化妆品等行业具有较高的应用价值。琼胶酶是一类能够催化琼胶降解为琼胶寡糖的酶，根据其裂解琼胶的模式不同可将琼胶酶分为两类即α-琼胶酶和β-琼胶酶，其中α-琼胶酶切割琼脂糖的α-1,3键以产生琼脂寡糖，β-琼胶酶切割β-1,4键以产生新琼寡糖，申请人在先申请的中国专利申请CN106544333A公开了一种源自柠檬假交替单胞菌Pseudoalteromonas citrea YTW1-15-1的β-琼胶酶——琼胶酶Aga0917，并提供了相应的载体和重组表达菌株。并指出该琼胶酶对琼脂糖进行降解，能够获得单一类型的琼胶寡糖——新琼四糖，其主要酶学性能如下：最适反应温度为60℃；50℃下30min仍能保持57％以上的活性；最适反应pH值为7.0；在pH6～9下能保持82.4％以上的活性。虽然琼胶酶Aga0917的酶学性能较好，但是因耐热能力的不足，该酶无法在高温下长时间的保持活性，在用于实际生产时无法充分发挥活性。因此。为此进一步对其进行改进，提高琼胶酶Aga0917的性能使其更能适用于生产应用是目前亟待解决的问题。

发明内容

为解决前述技术问题，本发明将琼胶酶Aga0917的氨基酸序列进行了重组，的发现通过基因工程技术，进行定点突变将第140位的缬氨酸Val,突变为脯氨酸Pro，可以提高琼胶酶的热稳定性以及在高温下的酶的活力。

基于上述发现，本发明为解决前述即使是问题采用的技术方案为：提供一种重组琼胶酶，所述重组琼胶酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明提供了所述重组琼胶酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

本发明还提供了所述的重组琼胶酶在制备琼胶寡糖上的应用。

本发明提供的技术方案的有益效果为：通过重组琼胶酶Aga0917氨基酸序列，意外的发现当对定点突变将第140位的缬氨酸Val,突变为脯氨酸Pro，可以提高琼胶酶的热稳定性以及在高温下的酶的活力。本发明提供的重组琼胶酶，其最适反应温度为45～50℃，在45℃度下可以长时间(超过1h)的保持酶的高活性。从而可以充分利用最适反应温度进行酶解反应，与重组前的琼胶酶aga0917相比，在长期保持活性的45℃条件下，重组琼胶酶的酶活力显著提高，更有利于持续进行酶解生产。

附图说明

图1为实施例1中基因Aga0917的PCR结果电泳检测图

图2为实施例2中基因V140P的PCR结果电泳检测图

图3为实施例3中pMD19^T-Aga0917克隆载体双酶切电泳检测图

图4为实施例3中pMD19^T-V140P克隆载体双酶切电泳检测图

图5为实施例4中pET28a-Aga0917双酶切电泳检测图

图6为实施例4中pET28a-V140P双酶切电泳检测图

图7为实施例5中重组琼胶酶的蛋白电泳图