[发明专利]丛枝菌根真菌的球囊霉素基因及其球囊霉素的制备方法

说明书

本发明公开了一种丛枝菌根真菌的球囊霉素基因及其球囊霉素的制备方法，所述球囊霉素基因glomalin CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该方法将含有将球囊霉素的DNA片段的宿主细胞经IPTG诱导表达；收集细菌，破碎，离心，获得融合蛋白；融合蛋白经Ni‑亲和层析柱进行纯化，获得目的蛋白，即为球囊霉素。本发明可以便捷高效的获取高纯度的球囊霉素，并具有高表达低成本等优点。为球囊霉素复合物的结构解析奠定基础。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种丛枝菌根真菌的球囊霉素基因及其球囊霉素的制备方法。

背景技术

随着工业日益发展，我国CO₂排放逐渐增多和土壤退化，土壤有机质(SOC)含量减少等因素都不同程度导致土壤质量下降。球囊霉素是1996年在球囊霉属丛枝菌根真菌Glomus intraradices(现命名为Rhizophagus irregularis)菌丝表面发现的一类糖蛋白。它具有多年或更长的周转时间，因此在土壤中大量积累，并因此成为土壤有机质(SOM)的重要组成部分，对土壤聚集、碳储存和土壤质量改善至关重要。据报道，球囊霉素是最重要的土壤有机碳(SOC)来源，碳含量丰富(5-13％)，因此，它可以作为生物固碳的“得力干将”。通过将碳元素固定在土壤中可以很大程度上降低大气中的碳含量(CO₂)，有助于维持“碳平衡”。此外，它作为一种“超级胶”，可以将土壤小颗粒与直径小于0.25mm的微团聚体结合，促进土壤团聚体的形成，土壤团聚体的稳定性可以改善土壤结构，极大地提高土壤水分的渗透性、土壤稳定性以及防止自然侵蚀的能力，同时其合理的多孔结构为植物根系生长提供了必要的空间和较好的气体交换通道。

传统上，球囊霉素在柠檬酸钠缓冲液中单独或重复高压灭菌土壤样品进行提取，以分别获得易提取球囊霉素和总球囊霉素。此方法提取的球囊霉素可通过使用非特异性Bradford蛋白测定法或特异性的单克隆抗体MAb32B11免疫反应物质对蛋白含量进行评估。然而，上述提取方法仍然有以下几点问题：

1)传统提取方法获得的提取物虽然在一定程度上对球囊霉素进行了提纯，但仍是含有各种蛋白质和其他化合物的混合物，如非AMF分泌的蛋白质、脂类和腐殖质物质等，因此，2006年重新命名为球囊霉素相关土壤蛋白(简称GRSP)；

2)现有的两种蛋白测定法均不能完全排除其他化合物的影响，这制约了人们对球囊霉素在土壤中的分布及其环境功能的深入了解；

3)由于不能得到高纯度的球囊霉素组分用于分析其分子结构和功能，严重限制了其相关的分子生物学及生物化学方面的研究。

因此，提取高纯度球囊霉素的方法亟待发明，但到目前为止，仍未发现获得高纯度球囊霉素的提取方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种丛枝菌根真菌的球囊霉素基因及其球囊霉素的制备方法，本发明通过基因工程离体表达纯化球囊霉素，该方法安全有效，低风险，生产效率高，适宜于工业化生产。

为实现上述目的，本发明所设计一种丛枝菌根真菌的球囊霉素基因glomalin，所述球囊霉素基因glomalin CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了一种上述的球囊霉素基因编码的球囊霉素，所述球囊霉素的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体为含有上述的球囊霉素基因的表达载体，其中，所述表达载体为pET21b。

本发明还提供了一种含有上述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)感受态。

本发明还提供了一种上述宿主细胞的构建方法，包括以下步骤：

1)提取丛枝菌根真菌的基因组；

2)设计引物对：