[发明专利]丛枝菌根真菌的球囊霉素基因及其球囊霉素的制备方法

权利要求书

1.一种丛枝菌根真菌的球囊霉素基因glomalin，其特征在于：所述球囊霉素基因glomalin CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种权利要求1所述的球囊霉素基因编码的球囊霉素glomalin，其特征在于：所述球囊霉素的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为含有权利要求1所述的球囊霉素基因的表达载体，其中，所述表达载体为pET21b。

4.含有权利要求3所述重组表达载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)感受态。

5.一种权利要求4所述宿主细胞的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)提取丛枝菌根真菌的基因组；

2)设计引物对：

引物对1：

5’-ATGCAGCGCGTCTCACAATTTTTCAATAAA-3’，

5’-TTACATCATACCCATATCACCCATTCCACC-3’；

引物对2：

5’-TTTCTCCTTCCCTATCTATGGTATCT-3’，

5’-CGGCTCCCTTATTTTCCTCTA-3’；

引物对3：

5’-gtacttccaatccaatgctATGCAGCGCGTCTCACAATTTTTC-3’，

5’-CGTCTTgaaccaaccttgCACCAAGGTTTTCAAATTTGTC-3’；

引物对4：

5’-TGcaaggttggttcAAGACGTTGCCAACAAAACTAATGAAGTGG-3’，

5’-TGGCTGAGATTgtagcaacctgaGCTATTTCTTCACTTGTAG-3’；

引物对5：

5’-ggttgctacAATCTCAGCCAATGGTGATACGCATGTTGG-3’，

5’-TATTTTCCTctggagCTTCGGTAATTGTGCATTCTGTCGTTG-3’；

引物对6：

5’-CGAAGctccagaggaaaAGGAAAATAAGGGAGCCG-3’，

5’-gagctcgaattcggatccTTACATCATACCCATATCACCCATTCC-3’；

3)以丛枝菌根真菌的基因组为模板，进行PCR；得到球囊霉素的DNA片段；

4)将球囊霉素的DNA片段克隆到大肠杆菌表达载体pET21b中，构建融合重组表达载体pET21b-glomalin；

5)将重组表达载体转入大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)感受态中，得到宿主细胞。

6.离体表达纯化获得高纯度球囊霉素的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将权利要求4所述的宿主细胞经IPTG诱导表达；

2)收集细菌，破碎，离心，获得融合蛋白；

3)融合蛋白经Ni-亲和层析柱进行纯化，获得目的蛋白，即为球囊霉素。

7.根据权利要求6所述离体表达纯化获得高纯度球囊霉素的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，收集细菌细胞后，重悬在Binding buffer中，用高压破碎仪进行破碎，其中，所述Binding buffer包括20mM Tris，300mM NaCl，20mM Imidazole。

8.根据权利要求6所述离体表达纯化获得高纯度球囊霉素的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，离心条件为12000r/min、4℃离心1h。

9.根据权利要求6所述离体表达纯化获得高纯度球囊霉素的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，Ni-亲和层析柱先用Binding buffer平衡，然后将离心后蛋白上清液倒入层析柱中，再用Wash Buffer洗杂蛋白，最后用Elution Buffer洗脱目的蛋白。

10.根据权利要求9所述离体表达纯化获得高纯度球囊霉素的制备方法，其特征在于：所述Binding buffer包括20mM Tris，300mM NaCl，20mM Imidazole；

所述Wash Buffer包括20mM Tris，300mM NaCl，40mM Imidazole；

所述Elution Buffer包括20mM Tris，300mM NaCl，1M Imidazole。