[发明专利]三重四级杆液质联用法同时检测毒黄素和米酵菌酸的方法

说明书

本发明属于分析检测技术领域，涉及一种同时检测毒黄素和米酵菌酸含量的方法,包括以下步骤：样品经过前处理，利用三重四级杆液相色谱质谱(UPLC‑MS/MS)同时测定食品中毒黄素和米酵菌酸的含量。样品在80％甲醇水溶液体系中超声萃取，离心后上清液经净化处理，浓缩、复溶后，以0.1％甲酸水和乙腈为流动相经梯度洗脱，液质电喷雾离子源正负模式检测，外标法定量。结果表明，该方法灵敏度高、专属性好、准确可靠，适合食品中毒黄素和米酵菌酸含量的测定。

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，涉及一种同时检测毒黄素和米酵菌酸含量的方法。

背景技术

椰毒假单胞菌酵米面亚种(Psedomonas cocovenenans subsp.farinofermentans)，在我国最早出现的报道是上世纪七十年代中期东北酵米面中毒食品事件中，该毒菌与1934年印度尼西亚发酵豆制品食物中毒分离株同源，其主要存在于发酵的粮食及其加工品、变质的食用菌以及周围环境中，它是酵米面及变质银耳中毒的病原菌。在一定的温度、湿度等环境条件下，椰酵假单胞菌有一定的几率产生米酵菌酸(Bongkrekic acid,BA)和毒黄素(Toxofl avin,TF)两种毒素。米酵菌酸作用于肝脏、脑、肾及心脏等器官，作用机制为抑制线粒体上腺嘌呤核苷酸转移酶(ANT)的活性，导致细胞凋亡、损害；毒黄素进入细胞，从还原性辅酶I接收氢再转交氧分子，产生大量过氧化氢，而表现毒性。米酵菌酸对酸、氧化剂和日照不稳定，但在高温条件下依然稳定存在。即使是100℃沸水甚至是120℃以上高温，米酵菌酸依然未被破坏，故熟食仍然有中毒的风险。因此家庭日常的烹饪方式并不能有效防止椰酵假单胞菌中毒事件的发生。

目前，针对米酵菌酸的检测,常用的方法包括液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。现行的食品安全国家标准GB 5009.189-2016方法灵敏度有待提高且前处理消耗大量有机试剂、试验步骤较多用时较长，而毒黄素暂无国家标准方法。本课题组采用QuEChERSEMR-Lipid技术处理样品，建立了同时测定食品中毒黄素和米酵菌酸含量的高效液相色谱法，但该方法检出限较高，对于考察椰毒假单胞菌酵米面亚种产毒机理及毒黄素和米酵菌酸的产毒机制灵敏度不够；而在液相色谱-串联质谱法方面，Fenwick MK开发了液相色谱质谱法测定培养液中毒黄素的含量，但该方法的样品处理部分并不完全适用于普通食品的检测，张伟等开发的超高效液相色谱-三重四极杆/复合线性离子阱串联质谱法快速检测食物中毒样品中的毒黄素适用固相萃取法进行前处理对毒黄素的检测效率有较大提高，但不能兼具同时提纯富集米酵菌酸的作用；曾雪芳等采用超高效液相色谱串联质谱法测定米粉和河粉中的米酵菌酸，采用混合阴离子交换柱进行净化处理，与国标方法相比，采用液质联用可提高准确度、灵敏度和检测效率。周鹏等采用液相色谱-串联质谱法测定银耳中的米酵菌酸，采用混合强阴离子交换柱进行净化处理，方法准确性和灵敏度得到提高。近年李红艳；张东雷等开发了基于固相萃取-高效液相色谱法的复杂食品基质中细菌性毒素米酵菌酸和毒黄素检测方法采用混合型弱阴离子小柱(WAX)和多功能净化MycoSep 226分别对米酵菌酸和毒黄素进行净化，再合并浓缩后测定，该方法虽然在最终检测上实现了同时测定,但其前处理过程是分开提取的并不是真正意义上的同时检测方法，因此亟需开发一种灵敏度高的能同时对毒黄素和米酵菌酸进行检测的方法，以实现一次处理一次检测毒黄素和米酵菌酸的可行性方案。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供三重四级杆液质联用法同时检测毒黄素和米酵菌酸含量，利用三重四级杆液质联用手段，建立适用于易被椰毒假单胞菌酵米面亚种污染的食品，同时满足毒黄素和米酵菌酸的提取、浓缩的检测方法，以实现一次提取、同时检测痕量毒黄素和米酵菌酸的高灵敏度、高效率、准确度高的试验方案。

本发明将通过以下技术方案解决上述问题：

三重四级杆液质联用法同时检测毒黄素和米酵菌酸的方法，包括以下步骤：

a.样品提取：将经过粉碎后的样品加入离心管中，均质后加入甲醇水溶液，混匀后超声萃取，离心，取上清液；