[发明专利]链霉亲和素-生物素的结合效率定量测定的方法及应用

说明书

本申请涉及化学蛋白质组领域，尤其涉及链霉亲和素‑生物素的结合效率定量测定的方法及应用，其中测定的方法采用荧光素‑生物素‑叠氮代替现有的生物素‑叠氮，通过凝胶电泳‑胶内荧光强度直接扫描检测，可获取准确的富集效率。另外将该方法应用于提高链霉亲和素‑生物素的结合效率中，筛选出富集效率高的缓冲液为溶有0.05%SDS的PBS缓冲液，并且间隔固定时间分批次加入链霉亲和素偶联磁珠也可提高结合效率。

技术领域

本申请涉及化学蛋白质组领域，尤其涉及链霉亲和素-生物素的结合效率定量测定的方法及应用。

背景技术

化学蛋白质组学技术的不断发展，为生物体系中的小分子化学药物作用机制的探究提供了新的思路。链霉亲和素-生物素以其极高结合亲和力（解离常数Kd≈10⁻¹⁴ mol/L），高度选择性和稳定性而被广泛应用于分子科学的相关研究中。近年来，随着新的链霉亲和素变体被用于蛋白质纯化，以及选择性生物素化的方法被应用于体外和体内研究，使得链霉亲和素-生物素的相关应用在一定程度上迎来了复兴。除了广泛应用的检测、标记和药物传递等领域外，链霉亲和素-生物素在催化、细胞生物学和化学蛋白质组学领域也取得了显著的发展(Christopher M. Dundas et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97,9343–9353)。

随着该方法的应用逐渐推广，在复杂蛋白质组体系中链霉亲和素-生物素的结合效率的定量测定也变得尤为重要，例如在不同的生物缓冲液中链霉亲和素偶联磁珠对生物素化蛋白质组的富集效率，该过程的定量分析对于化学蛋白质组学样品的制备至关重要。通常，化学蛋白质组学样品制备过程包括将生物素化（外源化学或酶法引入）的蛋白质与背景蛋白质（无生物素化修饰）分离，该过程可以借助于链霉亲和素偶联磁珠完成，如果富集效率较低则会造成最终样品中靶标蛋白质的丰度较低，导致实验组和空白组的差异不明显而不能有效检测，同时会严重影响实验结果的重复性。在一些实验研究中，研究人员一般会试图提高链霉亲和素偶联磁珠的用量或蛋白质组样品的进样量来解决以上问题，这使得成本大幅度提升。尤其是，对于一些较为珍贵的样品（病人组织，体液等），实验结果的准确性和可重复性显得尤为重要。

为了能够比较溶液中生物素修饰水平的变化，通常会选用炔基碘乙酰胺探针（IA），该探针已经被广泛应用于蛋白质组中半胱氨酸残基标记研究。IA探针共价标记半胱氨酸残基后，末端炔基能够和叠氮基团发生生物正交偶联反应，从而引入功能性化学修饰。其中，生物素-叠氮（Biotin-PEG₃-azide）是用于引入外源生物素修饰的常用标签试剂之一，通过点击化学与IA探针耦合，从而对IA探针标记的蛋白质组进行高效生物素化修饰，能够被后续链霉亲和素偶联磁珠富集分离，供检测分析。

然而，若比较富集分离前后，溶液中生物素修饰强度变化，传统方法一般是进行免疫印迹分析，结合带有荧光基团标记的链霉亲和素蛋白质能够对生物素修饰强度进行定量分析。该方法不足之处在于实验操作流程较为繁琐，需进行以下步骤：凝胶电泳，转膜，封闭，抗体孵育及荧光强度定量检测等。同时，当外源性引入生物素修饰强度较低（化学探针标记强度较低）时，内源性生物素修饰会产生较强的背景信号，无法对所关注的外源性生物素修饰水平变化进行定量比较。同时，由于该过程涉及步骤较为繁琐，容易引入实验操作误差，不利于广泛应用于链霉亲和素偶联磁珠富集效率定量分析中。

发明内容

为了简化测定方法，以及减少内源生物素背景信号的干扰，确保测定结果的准确性，本申请提供的链霉亲和素-生物素的结合效率定量测定的方法，将荧光素-生物素-叠氮代替现有的生物素-叠氮，通过凝胶电泳-胶内荧光强度直接扫描检测，可获取准确的富集效率。另外将该方法应用于提高链霉亲和素-生物素的结合效率中，筛选出富集效率高的缓冲液为溶有0.05% SDS的PBS缓冲液，并且间隔固定时间，分批次加入链霉亲和素偶联磁珠也可提高结合效率。

本申请一方面提供链霉亲和素-生物素的结合效率定量测定的方法，包括：

使用炔基碘乙酰胺探针标记蛋白质组。