[发明专利]基于DIA技术探究和分析不同民族人乳中差异蛋白的方法

说明书

本发明的基于DIA技术探究和分析不同民族人乳中差异蛋白的方法属于乳品技术领域。步骤包括：样品采集、乳清蛋白提取和分离、过滤辅助样品制备酶解、建库样本准备、DDA建库数据采集、DIA进行生物样本定量数据采集、差异表达蛋白质筛选及功能分析等。本发明首次从不同民族的人乳差异性出发，采用DIA技术对朝鲜族和汉族母乳中的乳蛋白进行系统化、高通量的研究，并进行比较分析，鉴定出的总蛋白种类多，能全面的获得不同民族之间人乳蛋白的差异，为开发针对特定人群的创新性婴幼儿配方食品提供技术支持和新的研发思路。

技术领域

本发明属于乳品技术领域，具体涉及一种基于数据非依赖采集的蛋白组学技术(DIA)对采集的不同民族的人乳进行蛋白组成和含量差异性比较分析的方法。

背景技术

母乳是婴儿最天然、最理想的食物，为新生儿提供生长发育所必需的营养，并增强抵抗力。在这种情况下，作为母乳替代物，婴幼儿配方粉的科学设计和研发具有重要的意义。

为使婴幼儿能够获得更接近母乳的营养成分，国内外相关研究机构长期深入探索母乳组分，试图找到最符合母乳的营养均衡型婴幼儿配方乳粉。我国在母乳研究营养成分上取得了一定的研究成果，相关机构纷纷建立了中国母乳营养成分数据库，但仍存在样本地域碎片化、样本分析常规化的不足。我国人口众多、地域辽阔、膳食多样，如何利用现代技术详尽地分析中国母乳功能组分，将常规母乳营养素研究扩展到更加细微的母乳成分研究显得至关重要。我国东北朝鲜族、西北地区等母乳研究较少，对母乳的蛋白质组学研究也较少。而相关研究表明，母乳成分受种族、饮食等多种因素影响。因此，探究不同民族人乳之间的营养成分的差异性，并开发针对性的婴配粉具有重要意义。

乳主要包括乳蛋白、乳糖和乳脂等多种营养成分，其中乳蛋白质是最重要的组成成分。乳蛋白质可以为新儿和哺乳动物提供氮、酶、激素及免疫物质等，对其健康成长有重要的作用。乳中含有种类多样、含量丰富的蛋白质，由于遗传变异和翻译后修饰对乳蛋白的影响，使乳蛋白的组成变得复杂、庞大。其中酪蛋白(CN)、乳清蛋白(WP)和乳脂球膜蛋白(MFGM)是乳蛋白的重要组成部分。蛋白质组学是研究蛋白组的一个新的领域，主要研究蛋白质的特性，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质相互作用，在蛋白质水平上了解细胞的各项功能、各种生理生化过程以及疾病的病理过程等。

采用蛋白质组学等技术对中国东北延边地区的朝鲜族和汉族人乳进行详细的分析和比较，探索民族差异对母乳中营养成分的影响，建立特色人群母乳数据库，为开发更加接近特定人群母乳营养成分及功效的婴幼儿配方奶粉提供依据，未来将有更多的婴幼儿受惠于针对性母乳数据库。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对蛋白种类繁多的我国不同民族的母乳，提供一种通过对样品进行高速分离得不同的乳清蛋白层、酪蛋白层和乳脂肪球膜蛋白层，并采用DIA技术对蛋白进行高通量分析的方法。为了达到上述技术效果，本发明包括以下技术方案：

一种基于DIA技术探究和分析不同民族人乳中差异蛋白的方法，有以下步骤：

步骤1：样品采集

采集不同民族新鲜母乳，每例30毫升放入50毫升的无菌离心管中，并贴上标签，获得的样品立即放置在-80℃的冰箱中储存，同一民族随机6～10个样品混合成一个混合样品，每个民族收集至少三个平行的混合样本进行生物学重复；

步骤2：乳清蛋白提取和分离

将蛋白酶抑制剂加入母乳样品，取12mL母乳样品装入15mL离心管；4℃，3000rpm，离心30min分层，最上层为脂肪层，贴挂侧管壁，轻柔倒出下层脱脂奶液至新管，留脂肪层于原离心管中；磷酸缓冲液(PBS)冲洗脂肪层5次，4℃存放待用；脱脂奶液取1mL用10％乙酸调节溶液pH值至4.6，用于酪蛋白析出，4℃，10000rpm，离心15min，使乳清蛋白与酪蛋白分离；