[发明专利]基于DIA技术探究和分析不同民族人乳中差异蛋白的方法

权利要求书

1.一种基于DIA技术探究和分析不同民族人乳中差异蛋白的方法，有以下步骤：

步骤1：样品采集

采集不同民族新鲜母乳，每例30毫升放入50毫升的无菌离心管中，并贴上标签，获得的样品立即放置在-80℃的冰箱中储存，同一民族随机6～10个样品混合成一个混合样品，每个民族收集至少三个平行的混合样本进行生物学重复；

步骤2：乳清蛋白提取和分离

将蛋白酶抑制剂加入母乳样品，取12mL母乳样品装入15mL离心管；4℃，3000rpm，离心30min分层，最上层为脂肪层，贴挂侧管壁，轻柔倒出下层脱脂奶液至新管，留脂肪层于原离心管中；磷酸缓冲液冲洗脂肪层5次，4℃存放待用；脱脂奶液取1mL用10％乙酸调节溶液pH值至4.6，用于酪蛋白析出，4℃，10000rpm，离心15min，使乳清蛋白与酪蛋白分离；

乳清蛋白沉淀：在乳清蛋白与酪蛋白分离后，取上清液，加入4倍体积预冷丙酮，-20℃过夜，沉淀用预冷丙酮清洗3次，得到乳清蛋白沉淀，吹干备用；

酪蛋白沉淀：在乳清蛋白与酪蛋白分离后，除去上清液，沉淀即为酪蛋白，预冷丙酮清洗3次，吹干备用；

脂肪蛋白提取：在母乳样品进行离心分离后得到的脂肪层中加入3倍体积甲醇，涡旋震荡，至脂肪层破碎悬浮于甲醇，4℃，9000g，离心10s；除去上清液，加入体系2倍体积的氯仿，涡旋震荡，至沉淀悬浮于氯仿；向体系中加入体系3倍体积去离子水，混匀，4℃，9000g，离心1min，溶液分三层，下层为氯仿，中间层为蛋白层，将上清液移除，向剩余体系中加入3倍体积甲醇，混匀，4℃，9000g，离心2min；除上清，将沉淀用甲醇洗涤2次，吹干，沉淀即为脂肪蛋白；

步骤3：过滤辅助样品制备酶解

基于过滤辅助样品制备方法，对100μg蛋白质样品进行蛋白质酶水解，所述的蛋白质样品是步骤2中分离出的乳清蛋白、酪蛋白、脂肪蛋白的一种，向蛋白质样品中添加8M尿素，使总体积达到200μL，加入二硫苏糖醇至体系中DTT最终浓度为10mM，并使混合物在56℃下静置30分钟，添加碘乙酸至碘乙酸的终浓度为50mM，并在室温下无光反应40min，将样品转移到10K超滤管中，然后在室温下以12000g离心，弃掉滤液，并重复该步骤三次，添加200μL浓度为50mM的碳酸氢铵溶液，然后在室温下以12000g离心，丢弃滤液，并重复该步骤3次，将胰蛋白酶以样品:酶＝50:1的质量比添加到试管中，并在37℃下酶解16小时，通过在12000g、4℃下离心获得多肽样品，然后冷冻干燥；

步骤4：建库样本准备

酶解后的多肽样品在色谱仪中进行High pH反相色谱分级，柱子在初始条件下平衡5min，柱流速维持0.4mL/min；随后柱流速增至0.7mL/min，使用1.5ml EP管，每1分钟接收1管；

步骤5：DDA建库数据采集

另取酶解后的多肽样品经由轨道阱质谱仪进行分析；共上样18μL，以60/120min梯度分离：3％溶液B至100％溶液B；柱流量控制在600nL/min；所述溶液B为98％ACN，2％ddH2O，pH10；

轨道阱质谱仪在数据依赖采集模式下运行，质谱参数设置如下：(1)MSn1:扫描范围(m/z):375-1500；分辨率：120,000；AGCtarget:4e5；最大注入时间：50ms；(2)MSn2：分辨率：15,000；AGCtarget＝5e4；最大注入时间：22ms；碰撞能量：30％；将获得的质谱数据用ProteomeDiscoverer 2.1.0182进行蛋白质分析，最终获得DDA参考谱图库；数据处理参数为：搜库引擎采用SequestHT；蛋白质数据库用UniprotTaxId：9606；设置胰蛋白酶酶解；最大允许漏切位点设为2；肽段水平的假阳性率(FDR)设置为1％；肽和片段质量误差分别设置为±10ppm和±0.02Da；

步骤6：DIA进行生物样本定量数据采集

另取步骤3中的多肽样品经由轨道阱质谱仪进行分析；共上样18μL，以60/120min梯度分离：3％溶液B至100％溶液B；柱流量控制在600nL/min；

轨道阱质谱仪在数据依赖采集模式下运行，质谱参数设置如下：(1)MSn1:扫描范围(m/z):350-1500；分辨率：60,000；AGCtarget:4e5；最大注入时间：50ms；(2)MSn2：分辨率：30,000；AGCtarget＝3e5；最大注入时间：54ms；碰撞能量：33％；

用Skyline软件进行DIA分析，通过导入步骤5所得的DDA参考谱图库，对DIA原始数据进行多肽信号提取与定量分析，设置参数为：多肽长度选6-25；子离子m/z要求为大于母离子且last ion-3；子离子最大数目设为5；子离子最小数目设为2；子离子抽提窗口采用5min；Dotp需要大于等于0.6；

步骤7：差异表达蛋白质筛选

将符合FC1.5或0.67，且Pvalue0.05的蛋白设定为差异表达蛋白，并进行GO和KEGG功能富集分析和蛋白互作分析。