[发明专利]一种创制香禾糯新种质的方法

说明书

本发明公开了一种创制香禾糯新种质的方法，该方法包括：选择功能缺失产生短芒或无芒的基因RAE2和选择功能缺失产生半矮秆表型的基因SD1；选择基因RAE2和SD1的编辑位点，构建CRISPR/Cas9基因编辑载体；将CRISPR/Cas9载体导入愈伤组织，通过抗性筛选和分化培养得到Tsubgt;0/subgt;代转基因植株，并通过扩增载体DNA片段筛选Tsubgt;0/subgt;代转基因阳性植株；扩增Tsubgt;0/subgt;代阳性植株的靶位点DNA，TA克隆测序，筛选功能基因敲除的突变株系；Tsubgt;0/subgt;代突变株系自交获得Tsubgt;2/subgt;株系，筛选芒长基因RAE2和半矮秆基因SD1发生纯合突变的改良株系。通过本申请解决相关技术中通过CRISPR/Cas9基因编辑技术得到的新种质，明显降低株高和芒长性状。

技术领域

本发明基因工程技术领域，具体为一种创制香禾糯新种质的方法。

背景技术

香禾糯是指分布在黔东南州一类经长期自然与人工选择环境下形成的，适应特殊生态环境的特色稻资源。香禾糯具有色泽光亮、米体滚圆、香味浓郁、口感细腻、黏度适中、油脂多而不腻、耐水浸泡等优良食味品质。素有“一家蒸饭满寨香”的美誉，被称为“糯中之王”。但香禾糯株型较高、易倒伏、芒较长等不利性状，增加其生产成本，极大的限制其产业发展。

近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术发展较为迅速。CRISPR/Cas9系统已经逐渐发展为遗传育种中改良作物的有效手段，可针对某些特色优质稻却存在不利性状的材料进行定向基因位点编辑，从而获得兼具优良品质与性状的新种质。

但是，根据具体品系，研究其中基因与性状的关联，如何选择适合的载体、引物等则是该项技术的难题

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种创制香禾糯新种质的方法，该方法包括：根据水稻芒长和株高基因作用机理，选择功能缺失产生短芒或无芒的基因 RAE2和选择功能缺失产生半矮秆表型的基因SD1；选择基因RAE2和SD1的编辑位点，构建CRISPR/Cas9双基因双靶点基因编辑载体；以目标水稻品种为遗传受体，将CRISPR/Cas9载体导入愈伤组织，通过抗性筛选和分化培养得到T₀代转基因植株，并通过扩增载体DNA片段筛选T₀代转基因阳性植株；扩增T₀代阳性植株的靶位点DNA，TA克隆测序，筛选功能基因敲除的突变株系；T₀代突变株系自交获得T₂株系，筛选芒长基因RAE2和半矮秆基因SD1发生纯合突变的改良株系。通过本申请解决相关技术中通过CRISPR/Cas9基因编辑技术得到的新种质，明显降低株高和芒长性状。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：创制香禾糯新种质的方法，包括如下步骤：

1)选择基因芒长基因LOC_Os08g37890(RAE2)和半矮秆基因LOC_Os01g66100(SD1)的基因编辑位点，构建双基因双靶点的CRISPR/Cas9 载体；

2)以水稻品种香禾糯地方品种苟岑告为遗传受体，将CRISPR/Cas9载体导入愈伤组织，通过抗性筛选和分化培养得到T₀代转基因植株；

3)通过扩增CRISPR/Cas9载体DNA片段检测所述T₀代转基因植株是否为阳性植株；

4)扩增突变株系T₀代阳性植株的靶位点DNA，TA克隆测序，筛选功能基因敲除的突变株系；

5)在T₀突变株系的自交后代中筛选芒长基因RAE2和半矮秆基因SD1发生纯合突变，且株高和芒长获得显著改善株系，即获得所需的香禾糯新种质。