[发明专利]一种创制香禾糯新种质的方法

权利要求书

1.一种创制香禾糯新种质的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)选择基因芒长基因LOC_Os08g37890-RAE2和半矮秆基因LOC_Os01g66100-SD1的基因编辑位点，构建双基因双靶点的CRISPR/Cas9载体；

2)以水稻品种香禾糯地方品种苟岑告为遗传受体，将CRISPR/Cas9载体导入愈伤组织，通过抗性筛选和分化培养得到T₀代转基因植株；

3)通过扩增CRISPR/Cas9载体DNA片段检测所述T₀代转基因植株是否为阳性植株；

4)扩增突变株系T₀代阳性植株的靶位点DNA，TA克隆测序，筛选功能基因敲除的突变株系；

5)在T₀突变株系的自交后代中筛选芒长基因RAE2和半矮秆基因SD1发生纯合突变，且株高和芒长获得显著改善株系，即获得所需的香禾糯新种质。

2.根据权利要求1所述的创制香禾糯新种质的方法，其特征在于：所述的芒长基因LOC_Os08g37890和半矮秆基因LOC_Os01g66100靶点接头分别引物为SG1和SG2，引物SG1和SG2的序列分别为5’-GCGAGGGCGTACGCGTACCAGGG-3’和5’-GAGCCATTCGTGTGGCCGAACGG-3’。

3.根据权利要求1所述的创制香禾糯新种质的方法，其特征在于：所述的构建双基因双靶点的CRISPR/Cas9载体的具体方式为，将所连接好的载体通过热激法转入大肠杆菌DH5α中，挑斑摇菌后抽提质粒，进行PCR扩增，测序确认载体无误后转入农杆菌EHA105感受态细胞中。

4.根据权利要求1或3所述的创制香禾糯新种质的方法，其特征在于：所述的将CRISPR/Cas9载体导入愈伤组织包括：采用组织培养和农杆菌介导将CRISPR/Cas9载体导入愈伤组织。

5.根据权利要求4所述的创制香禾糯新种质的方法，其特征在于：采用组织培养和农杆菌介导将CRISPR/Cas9载体导入愈伤组织，包括：采用电击法转化农杆菌，将含有基因编辑系统的菌液转化到香禾糯地方品种苟岑告的愈伤组织中。

6.根据权利要求5所述的创制香禾糯新种质的方法，其特征在于：所述的通过抗性筛选和分化培养得到T0代转基因植株，包括：采用质量浓度为50mg/L潮霉素进行抗性筛选，通过共培养、预分化、生根获得再生组培苗，移栽到土壤中培养，即获得所述T0代转基因植株。

7.根据权利要求1所述的创制香禾糯新种质的方法，其特征在于：筛选功能基因敲除的突变株系，并且扩增突变株系的靶位点DNA，包括：取成活再生苗的叶片，抽提叶片组织DNA，通过载体引物Cas9-F和Cas9-R进行阳性植株鉴定，同时分别在LOC_Os08g37890和LOC_Os01g66100靶序列两侧设计扩增引物RAE2-F和RAE2-R，SD1-F和SD1-R来扩增测序筛选获得目标基因编辑信息。

8.根据权利要求7所述的创制香禾糯新种质的方法，其特征在于，扩增条件为：94℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，68℃延伸1.5min，32个循环，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

9.根据权利要求1-8任意一项所述的创制香禾糯新种质的方法，其特征在于：在后代中筛选RAE2和SD1纯合突变且株高和芒长获得显著改善株系，包括：将T0代突变的LOC_Os08g37890和LOC_Os01g66100基因双靶点材料，连续自交获得T2代种子，种植获得T2代植株，提取DNA用引物RAE2-F和RAE2-R，SD1-F和SD1-R来扩增测序筛选获得纯合突变体株系。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的创制香禾糯新种质的方法，其特征在于，所述方法还包括：田间农艺形状测定株高显著降低，且芒长显著改善的株系。