[发明专利]一种微波制备肿瘤细胞微颗粒的方法

说明书

本发明涉及一种微波制备肿瘤细胞微颗粒的方法，本发明的方法包括以下步骤：1、取肺腺癌细胞系LLC，并在培养皿中培养24h以上；2、对细胞进行微波加热处理；3、将微波处理后的细胞放入恒温培养箱培养24h；4、收集上一步培养后的培养皿中的细胞上清，采用密度梯度离心方法进行多次离心处理，最终得到的沉淀即为肿瘤细胞微颗粒TMP_MW。本发明通过微波制备TMP_MW，过程简单，且可同时提高细胞微颗粒的产量；微波照射肿瘤细胞后分泌提取得到的微颗粒保留部分肿瘤自身生物活性物质，具有改善肿瘤免疫环境及作为肿瘤治疗疫苗的潜能；TMP_MW可作为一种新型纳米材料，成为装载药物的平台，靶向生物治疗癌症等疾病。

技术领域

本发明涉及肿瘤抑制剂的治疗药物相关领域，具体涉及的是一种微波制备肿瘤细胞微颗粒的方法。

背景技术

数十年间，细胞外囊泡(EVs)在各大研究领域备受瞩目，并且正在高速发展。从细菌到哺乳动物的所有细胞类型均可分泌EVs，这是一种高度保守的生理过程。分泌出的EVs是由细胞膜包被的纳米级颗粒，同时负载多种来源于细胞的活性分子物质，在细胞间相互作用发挥着重要作用，调节生理及病理过程。EVs主要分成两大类：外泌体和细胞微颗粒(MPs，亦称为微囊泡)；前者大小约为40-150nm，后者直径范围在150至1000nm之间，因此又可以分别称为小EVs和大EVs。

目前肿瘤来源的细胞微颗粒(Tumor-derived MPs，即TMPs)在肿瘤发生发展、浸润转移、诱导耐药中的作用机制被广泛研究。例如，肿瘤细胞通过旁分泌增强与肿瘤或基质细胞间通讯，从而加速肿瘤生长并促进转移，还能介导生成免疫抑制型肿瘤微环境(TME)。另外，因为TMPs有着双层磷脂膜结构并携带细胞自身的生物活性物质，具有强大而灵活的可塑性及载药(小分子化合物、脂质、蛋白质或核酸等化合物)能力。目前有大量研究团队及生物公司正研发、采用不同生产、合成、修饰技术，不断创新改进，致力于改造TMPs，使其改头换面，成为一种有效的治疗肿瘤的手段。

肿瘤细胞微颗粒(TMPs)常常来源于人源性或鼠源性肿瘤细胞系。除此之外，也有研究者提取患者肿瘤组织中的TMPs用于研发创新性肿瘤治疗策略。值得一提的是为了得到TMPs，各种各样的加工、分离、提纯工艺不断涌现。提取TMPs最重要的核心步骤是离心，包括梯度离心和/或高速离心。然而出于不同的研究目的及技术水平，在离心得到TMPs前后往往存在着各具特色、不尽相同的处理策略，以此改变TMPs的生物学功能，达到治疗治疗肿瘤的目的。目前制备TMPs的方法主要有：

(1)状态良好的肿瘤细胞天然分泌TMPs。理论及实践中发现天然自分泌的TMPs具有促瘤作用，因此针对这些TMPs，研究者们选择在其自然分泌时给予细胞miRNA/siRNA转染等修饰处理，或分泌提取TMPs后再通过化学键偶联或物理穿孔/吸附等方法装载货物，以此赋予TMPs抑制或杀伤肿瘤细胞，增强疗效；

(2)肿瘤细胞经过紫外照射后提取TMPs。分离得到TMPs前需预留适当的细胞培养时间，使得紫外诱导细胞核损伤的肿瘤细胞分泌大量的TMPs。我们前期研究发现基于紫外照射制备的TMPs在体外具有一定的细胞毒性，但在动物模型中无明显抑瘤作用，因此还需额外的修饰加工使其获得控制/抑制肿瘤生长的能力，例如TMPs包裹甲氨蝶呤用于治疗晚期肺癌伴恶性胸腔积液的患者，结果提示具有一定的治疗价值。

(3)肿瘤细胞经过放疗刺激后分泌产生TMPs。有一些研究者已经发现放疗细胞后提取的TMPs可以通过诱导免疫源性死亡等路径在细胞及动物水平抑制癌细胞生长，同时比对紫外诱导后产生的TMPs，前者具有更强的细胞毒性。

(4)肿瘤细胞经药物处理后在应激状态下分泌TMPs。细胞受到药物(例如酪氨酸激酶抑制剂)刺激后处于应激状态时，发生细胞凋亡或死亡。在该过程中，肿瘤细胞更易分泌产生具有膜结构的微囊泡，并且其内容物与天然TMPs存在很大差异，例如肿瘤抗原成分增多使得TMPs免疫源性提高从而诱导特异性抗肿瘤免疫反应。