[发明专利]一种针对HER2的双特异性单域抗体及其编码序列和应用

说明书

一种针对HER2的双特异性单域抗体及其编码序列和应用，本发明靶向HER2的特异性抗体FBXT212及靶向IgG的特异性抗体FBXT311，通过人源化改造，获得人源化后的纳米抗体蛋白；两组纳米抗体选出优化分子后组合成双特异性抗体；本发明的方法获得了一系列靶向HER2和IgG的双特异性纳米抗体，其VHH链的框架区FR和互补决定区CDR的氨基酸序列，以及编码该纳米抗体或其VHH链的基因序列；本发明的纳米抗体基因序列，为靶向HER2的研究，包括抗体偶联药物及多特异性抗体药物开发提供了研发基础。

技术领域

本发明涉及生物医学或生物技术应用领域，尤其涉及一种针对HER2的双特异性抗体及编码序列和潜在应用方向。

背景技术

HER2属于酪氨酸激酶受体家族，家族有四个成员：HER1(也称为EGFR)、HER2、HER3和HER4。当被激活时，HER蛋白发生同源二聚或异源二聚并随后激活复杂的细胞信号级联，包括PI3K-AKT和RAS-MAPK(ERK)通路，这些通路调节细胞增殖和生存，以及肿瘤细胞的转移。HER2阳性肿瘤患者大都具有更加恶性的表型，肿瘤病灶的转移与侵袭能力较强，且对多数化疗药物治疗抵抗，术后复发机率较高。HER2在多种人类癌症中过表达，包括卵巢癌、结肠直肠癌和尿路上皮癌等。HER2已经成为治疗癌症的重要靶标。

在实际诊疗中，一方面由于存在HER家族受体的不完全抑制，如膜相关粘蛋白4(Membrane-associated mucin 4，MUC4)对HER2结合表位的遮蔽等，导致下游的存活和增殖信号通路重新被激活，另一方面，肿瘤内的异质性导致的对HER2信号传导具有生存依赖的细胞被清除，而没有HER2过表达的细胞则会继续生长，最终表现为治疗抗性。

单域抗体(Single domain antibody，sdAb，VHH)是具有抗原结合能力的最小抗体片段，VHH的本质是一个由110多个氨基酸组成的肽链，空间结构单一，却可以高强度地与特定的抗原结合，并且具有极强的热稳定性以及化学稳定性(例如清洁剂与尿素)。研究人员在1999年的一项研究中指出，一些特殊的VHH在90℃的高温下依旧保持很好的抗原结合能力，而几乎所有抗体在这一条件下都失去了活性。VHH也具有很强的抗胃酸以及胃蛋白酶能力，一些特殊序列的VHH可以通过口服的方法进入体内发挥活性。此外，VHH的抗原互补决定区(Complementarity determining regions，CDR)具有较大的环形结构，可以遮盖住通常与轻链结合的脂溶性位点，因此VHH脂溶性较低，容易在水溶液中溶解。此外，其结构简单，易于进行蛋白质的化学修饰。

但是，VHH实际应用中也存在缺陷，如在静脉给药后，单域抗体是具有抗原结合能力的最小的抗体片段。相较于抗体具有更好的组织和血管渗透性，在肿瘤中能有更为均质的分布。然而，单域抗体其本身分子量只有～15kDa，小于肾脏过滤蛋白质尺寸60kDa的阈值。在静脉给药后，这些单域抗体放射性示踪剂会通过肾小球滤过迅速从血液循环中清除，然后在近端小管中重新吸收，导致在肾皮质滞留时间较长，造成了非靶器官的毒性。目前，以单域抗体为靶向分子的放射靶向治疗研究中，常用的降低肾脏摄取，减小非靶器官毒性的策略是在治疗过程中共注射血浆扩容剂鱼精蛋白(gelofusin)或带正电荷的氨基酸(如精氨酸)，去除掉单域抗体C端组氨酸标签以降低极性等方。但是，由于单域抗体本身的血池代谢很快，所以肿瘤的绝对摄取值不高，单次给药的治疗效果较为一般，往往需要多次重复给药才能得到一定的治疗效果。