[发明专利]一种高效的农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化方法

说明书

本发明涉及一种高效的农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化方法，属于植物转基因技术领域，本发明包括以下步骤：（1）种子灭菌及预培养；（2）将步骤（1）中预培养的种子进行超声波处理；（3）农杆菌重悬液制备；（4）将步骤（2）中经过超声波处理的种子通过步骤（3）中制备的农杆菌重悬液在真空条件下进行农杆菌侵染；（5）将步骤（4）中经过侵染的种子与农杆菌进行共培养；（6）将步骤（5）中经过共培养的种子进行脱菌清洗后移栽；（7）阳性株系筛选与鉴定；（8）纯系抗性筛选；本发明通过超声波处理以及真空抽滤结合的辅助，优化重要影响因素，实现拟南芥原位遗传转化率提升以及GUS报告基因在转化株中的高效稳定表达。

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体的说，涉及一种高效的农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化方法。

背景技术

植物遗传转化(Plant Genetic Transformation)是应用DNA重组技术，将外源基因或DNA片段导入植物基因组，并使其稳定遗传和表达的技术，是植物基因工程的核心技术。植物的遗传转化技术大致可以分为三类：①载体介导转化法，主要有农杆菌Ti质粒和Ri质粒、植物病毒、人工染色体、RNA病毒、类病毒、线粒体DNA、叶绿体DNA、核复制子、S1类质粒等都可以作为植物遗传转化的载体系统。②DNA直接导入法，主要有基因枪法、电击法、PEG法、脂质体法、微束激光穿刺法、碳化硅纤维介导法、超声波法以及显微注射法。③种质系统转化法（germ line transformation），也叫生物媒体转化系统，即借助生物自身的种质细胞为媒体，特别是植物生殖系统细胞以及细胞自身结构来实现外源基因转化的系统。包括花粉管通道法、生殖细胞浸泡法、胚囊与子房注射法、萌发种子转化法等。本发明中的原位遗传转化法也即萌发种子转化法。

现有技术，对拟南芥原位遗传转化法的研究不够系统且不够深入，表现为遗传转化率较低，导致其应用程度大大受限。

因此，有必要开发一种高效的农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化方法，以提高拟南芥的遗传转化效率，有助于扩大其在基因编辑突变体株筛选中的应用前景。

发明内容

为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化法，通过对原位遗传转化过程中，包括预培养时间、超声波处理时间、农杆菌OD值，真空抽滤时间在内的重要影响因素进行优化，并且通过超声波处理和真空抽滤相结合的辅助方式，配合其它相关实施条件及步骤，最终实现GUS报告基因在转化株中的高效稳定表达，转化率可达到68%，具有显著提升。同时本方法不依赖于组织培养途径、不受限于植物基因型，操作更为简便。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

所述的高效的农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化方法包括以下步骤：种子灭菌及预培养：对拟南芥种子进行灭菌后，使用1/2 MS固体培养基对灭菌后的种子进行萌发预培养2-6天，所述1/2 MS固体培养基通过在1/2 MS液体培养基中加入琼脂粉制成；（2）将步骤（1）中预培养的种子进行超声波处理；（3）农杆菌重悬液制备；（4）将步骤（2）中经过超声波处理的种子通过步骤（3）中制备的农杆菌重悬液在真空条件下进行农杆菌侵染；（5）将步骤（4）中经过侵染的种子与农杆菌进行共培养；（6）将步骤（5）中经过共培养的种子进行脱菌清洗后移栽；（7）阳性株系筛选与鉴定：使用Basta除草剂对拟南芥转化株进行初筛，之后再取其叶片进行GUS组织化学染色和GUS目的基因的PCR鉴定；（8）纯系抗性筛选:收获步骤（7）筛选的转基因株系的T0代种子，播种于含有Basta除草剂的1/2 MS固体培养基进行抗性筛选，再对抗性筛选的种子进行移栽，收获T1代种子再播种于含有Basta除草剂的1/2 MS固体培养基进行抗性筛选，筛选获得T2代单株纯系种子。