[发明专利]一种高效的农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化方法

权利要求书

1.一种高效的农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化方法，其特征在于：包括以下步骤：

种子灭菌及预培养：对拟南芥种子进行灭菌后，使用1/2 MS固体培养基对灭菌后的种子进行萌发预培养2-6天，所述1/2 MS固体培养基通过在1/2 MS液体培养基中加入琼脂粉制成；（2）将步骤（1）中预培养的种子进行超声波处理；（3）农杆菌重悬液制备；（4）将步骤（2）中经过超声波处理的种子通过步骤（3）中制备的农杆菌重悬液在真空条件下进行农杆菌侵染；（5）将步骤（4）中经过侵染的种子与农杆菌进行共培养；（6）将步骤（5）中经过共培养的种子进行脱菌清洗后移栽；（7）阳性株系筛选与鉴定：使用Basta除草剂对拟南芥转化株进行初筛，之后再取其叶片进行GUS组织化学染色和GUS目的基因的PCR鉴定；（8）纯系抗性筛选：收获步骤（7）筛选的转基因株系的T0代种子，播种于含有Basta除草剂的1/2 MS固体培养基进行抗性筛选，再对抗性筛选的种子进行移栽，收获T1代种子再播种于含有Basta除草剂的1/2 MS固体培养基进行抗性筛选，筛选获得T2代单株纯系种子。

2.根据权利要求1所述的一种高效的农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化方法，其特征在于：步骤（1）中种子灭菌具体操作为：分装拟南芥种子于离心管中，用ddH₂O对其进行清洗，洗掉杂质，控干水分后加入75 %酒精浸泡种子45 S，再用ddH₂O清洗掉残余酒精，之后用含有Tween-20的10 %的次氯酸钠溶液浸泡种子15 min，浸泡期间摇匀3～4次，再用ddH₂O清洗种子，控干水分备用。

3.根据权利要求1所述的一种高效的农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化方法，其特征在于：所述每升1/2 MS液体培养基中加入7g琼脂粉。

4.根据权利要求1所述的一种高效的农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化方法，其特征在于：种子预萌发培养条件为：光照强度为700 μmol/m²·s，23-27 ℃，14 hrs光照/10 hrs黑暗。

5.根据权利要求1所述的一种高效的农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化方法，其特征在于：步骤（2）中超声波处理具体操作为：收集预培养后的种子，装入盛有1/2 MS液体培养基的容器中，放入超声波仪处理槽内处理1-3 min，功率为100 %，工作频率为53 kHz。

6.根据权利要求1所述的一种高效的农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化方法，其特征在于：步骤（3）中农杆菌重悬液制备具体操作为：挑取农杆菌单克隆进行活化后，取100 uL活化菌液至50 mL YEB培养基中进行扩大培养至OD₆₀₀值0.9-1.5，然后于4 ℃离心收集菌体，再用30 mL含5 %蔗糖和150 μM乙酰丁香酮的 1/2 MS液体培养基进行菌体重悬，静置1h待用。

7.根据权利要求1所述的一种高效的农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化方法，其特征在于：步骤（4）中农杆菌侵染具体操作为：在农杆菌重悬液中加入0.2 %的Silwett L-77，混匀后，将超声处理后的种子转移至装有农杆菌重悬液的容器中，通过真空泵对容器进行真空抽滤5-10 min，然后将容器封口并在120 rpm的条件下震荡培养20 min。

8.根据权利要求1所述的一种高效的农杆菌介导的拟南芥原位遗传转化方法，其特征在于：步骤（5）中共培养条件为：使用含150 μM乙酰丁香酮的1/2 MS固体培养基，在23-27℃条件下黑暗共培养3天。