[发明专利]一种纳米孔测序用测序接头的设计及应用

说明书

本发明公开了一种纳米孔测序用测序接头的设计及应用，通过对测序接头的引导序列进行特殊设计，省去了无碱基的空间子，大大降低了测序接头合成的成本，提高了测序效率。

技术领域

本发明涉及一种纳米孔基因测序接头的设计方法，尤其涉及一种pH控制的纳米孔测序用 测序接头复合物的核酸序列。

背景技术

纳米孔基因测序技术是近年来兴起的的新一代测序技术，其在原理上与其它测序方法有 根本性的差异。它基于膜片钳技术，利用生物纳米孔道独特的生物物理特性，通过检测单链 核酸通过孔道时引起通道电流的变化，来获取核酸的序列信息。但是如果不施加任何控制， 核酸序列在电压作用下通过纳米孔的速度非常快，导致获得的电流信号无法进行解码，因此 需要通过控速蛋白对核酸过孔速度进行必要的控制，增加每一个碱基的过孔时间以提高信号 分辨能力。此外，由于纳米孔只能通过单链核酸，在待测序列的最前端还需要一段额外的单 链片段来引导核酸通过纳米孔。因此，与二代测序类似，纳米孔测序实验也需要一个文库构 建步骤。在文库构建过程中，控速蛋白与待测核酸的单链区域结合，然后采用含有iSp18或 iSpC3等衔接子来阻滞控速蛋白前进。由于引导序列的存在，每条待测核酸上可能会结合不止 一个控速蛋白，这会导致测序信号的不稳定，纳米孔堵孔的概率大大增加，极大地降低了测 序效率。一种解决方案是采用带负电的无碱基的空间子来替代单链核酸片段，但合成包含这 些无碱基空间子的效率低下，且成本昂贵。因此仍然需要开发更优的引导链方法，以控制待 测核酸的过孔效率及易位速度并提高测序的效率。

发明内容

本发明人发现利用pH诱导的i-motif核酸二级结构可以很好地控制控速蛋白在引导链单链 区域的结合数量，由此实现了本发明。

发明第一方面提供用于表征靶多核苷酸的接头，所述接头含有四段区域：第一区段为用 于引导待测核酸进入纳米孔的单链核苷酸区域，第二区段为多核苷酸结合蛋白(核酸结合蛋 白或控速蛋白)结合区域，第三区段为阻滞多核苷酸结合蛋白前进衔接子区域，第四区段为 用于连接靶多核苷酸的区域，在所述第一区段，设有可形成i-motif二级结构的核酸片段，该 片段可依赖与pH值的不同，呈现单链或i-motif状态。

其中所述可形成i-motif二级结构的核酸片段为两个或多个。

其中所述两个或多个可形成i-motif二级结构的核酸片段为简单的重复单元，也可为不同 片段的组合。

其中所述可形成i-motif二级结构的核酸片段为人端粒i-motif序。

其中所述第二区段和第三区段为同一区段。

其中所述第四区段为连接待测核酸片段或靶核酸片段的双链区域。

其中所述第四区段为连接待测核酸片段或靶核酸片段的单链区域。

发明第二方面提供用于表征靶多核苷酸的构建体，所述构建体包含靶多核苷酸和上述任 一所述的接头，其中所述接头与所述靶多核苷酸的任一端或两端连接。

发明第三方面提供一种用于表征靶多核苷酸的复合物，其中，所述复合物包含多核苷酸 结合蛋白，和本发明所述的接头或本发明所述的构建体；

优选地，所述多核苷酸结合蛋白衍生自多核苷酸处理酶；所述多核苷酸处理酶选自聚合 酶、解旋酶或核酸外切酶。

发明第四方面提供构建用于表征靶多核苷酸的复合物的方法，所述方法包括：

1)构建含有可形成i-motif二级结构的核酸片段作为引导序列的接头；

2)将所述接头与待测核酸片段或靶核酸组装形成构建体；

3)任选在步骤2)之前或之后，在引导序列形成i-motif状态的条件下，将所述接头或构 建体与多核苷酸结合蛋白结合形成复合物，优选所述形成i-motif状态的条件为弱酸性，进一 步优选所述弱酸条件为pH6。