[发明专利]一种纳米孔测序用测序接头的设计及应用

权利要求书

1.一种用于表征靶多核苷酸的接头，所述接头含有四段区域：第一区段为用于引导待测 核酸进入纳米孔的单链核苷酸区域，第二区段为多核苷酸结合蛋白结合区域，第三区段为阻 滞多核苷酸结合蛋白前进的衔接子区域，第四区段为用于连接靶多核苷酸的区域，在所述第 一区段，设有可形成i-motif二级结构的核酸片段，该片段可依赖pH值的不同，呈现单链或 i-motif状态。

2.根据权利要求1所述的接头，其中所述可形成i-motif二级结构的核酸片段为两个或多 个。

3.根据权利要求2所述的接头，其中所述两个或多个可形成i-motif二级结构的核酸片段 为简单的重复单元，或为不同片段的组合。

4.根据权利要求1-3任一所述的接头，其中所述可形成i-motif二级结构的核酸片段为人 端粒i-motif序。

5.根据权利要求3或4所述的接头，其中所述第二区段和第三区段为同一区段。

6.根据权利要求1或2所述的接头，其中所述第四区段为连接靶多核酸的双链区域。

7.根据权利要求1或2所述的接头，其中所述第四区段为连接靶多核酸的单链区域。

8.一种用于表征靶多核苷酸的构建体，其中，所述构建体包含靶多核苷酸和权利要求1-7 中任一项所述的接头，其中所述接头与所述靶多核苷酸的任一端或两端连接。

9.一种用于表征靶多核苷酸的复合物，其中，所述复合物包含多核苷酸结合蛋白，和权利要求1-7中任一所述的接头或权利要求8所述的构建体；

优选地，所述多核苷酸结合蛋白衍生自多核苷酸处理酶；所述多核苷酸处理酶选自聚合 酶、解旋酶或核酸外切酶。

10.一种构建测序复合物的方法，所述方法包括：

1)构建含有可形成i-motif二级结构的核酸片段作为引导序列的接头；

2)将所述接头与待测核酸片段或靶核酸组装形成构建体；

3)任选在步骤2)之前或之后，在引导序列形成i-motif状态的条件下，将所述接头或构建体与多核苷酸结合蛋白结合形成复合物，优选所述形成i-motif状态的条件为弱酸性，进一 步优选所述弱酸条件为pH6。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述接头如权利要求1-7中任一项所定义。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述复合物结合1个所述多核苷酸结合蛋白；

优选地，所述多核苷酸结合蛋白衍生自多核苷酸处理酶；所述多核苷酸处理酶选自聚合 酶、解旋酶或核酸外切酶。

13.一种控制靶多核苷酸穿过跨膜孔的移动的方法，所述方法包括：

(a)实施权利要求10至12中任一项所述的方法；

(b)在引导序列形成单链的条件下，将步骤(a)中提供的装载有所述多核苷酸结合蛋白的靶 多核苷酸与所述跨膜孔接触，所述形成单链的条件为中性条件或弱碱性条件，优选为pH8.0；

以及

(c)跨所述跨膜孔施加电势，使得所述多核苷酸结合蛋白移动穿过接头中阻滞多核苷酸结 合蛋白前进的衔接子区域，并控制所述靶多核苷酸穿过所述跨膜孔的移动。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述方法包括提供系链用于使所述构建体靠近所 述跨膜孔；所述系链包括捕获区和锚定区，所述捕获区用于捕获所述构建体的接头，所述锚 定区用于与所述跨膜孔或所述跨膜孔所在的膜锚定结合。