[发明专利]一种自体癌性胸腹水来源的肿瘤浸润T淋巴细胞的扩增方法

说明书

本发明公开了一种自体癌性胸腹水来源的肿瘤浸润T淋巴细胞的扩增方法，属于细胞分离与培养技术领域，包括以下步骤：S1、自体胸腹水的采集；S2、待分选样本的准备；S3、分选磁珠的添加；S4、洗脱和上样；S5、非目标细胞的洗脱及目标细胞洗脱与收集；S6、肿瘤浸润T淋巴细胞的体外激活；S7、肿瘤浸润T淋巴细胞的体外扩增；S8、肿瘤浸润T淋巴细胞的鉴定和收获。本发明提供的扩增方法通过利用偶联CD3/CD28抗体的纳米级别颗粒激活分选纯化获得的肿瘤浸润T淋巴细胞，能够充分激活TIL细胞，使得TIL细胞的增殖能力得到了大幅度的提升，能够保证在培养结束时获得足量的TIL细胞。

技术领域

本发明属于细胞分离与培养技术领域，具体涉及一种自体癌性胸腹水来源的肿瘤浸润T淋巴细胞的扩增方法。

背景技术

随着人口老龄化的加剧，在未来，我国癌症发病以及死亡的情况不容乐观。因此临床上急需新的治疗手段去攻克肿瘤治疗这个世界性难题。

肿瘤的发生是体细胞基因突变的结果，通常机体的免疫系统会监控到这类异常体细胞的存在并通过细胞毒性作用将其消灭。但不幸的是肿瘤细胞不仅能够通过多种机制逃逸免疫系统的识别与攻击还可以通过肿瘤免疫微环境抑制免疫细胞发挥功能，为其进一步生长扩散提供条件，由此可见机体的免疫功能在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用，因此肿瘤免疫治疗技术应运而生。

目前肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)疗法已成为实体瘤治疗领域的新星。其原理是将来源于患者肿瘤组织或癌性胸腹水中的肿瘤浸润淋巴细胞，主要是CD8⁺T淋巴细胞提取出来，经过体外的大量扩增再回输入患者体内，接着需要衔接IL-2的注射以维持TIL细胞的活性。进入患者体内的TIL细胞能够有效迁移到肿瘤病灶处，在特异性识别肿瘤细胞之后发挥抗肿瘤作用。和其他的细胞治疗方法相比，TIL细胞杀伤癌细胞的过程具有特异性强、灵敏度高，肿瘤趋化性好以及机体耐受性好的巨大优势。TIL细胞疗法已经在黑色素瘤领域取得了举世瞩目的治疗效果，总有效率约为50％，而且高达25％的患者在接受治疗后维持着持久的完全缓解。

TIL疗法成功的首要关键问题在于如何能够在一定时间内在体外扩增出大量以及抗肿瘤活性强的TIL细胞，然而在进行TIL细胞的体外扩增时通常会遇到两大问题：其一是TIL的来源问题，如果从肿瘤组织中获取TIL细胞，牵扯到需要临床配合以及肿瘤组织消化操作的复杂性，不仅患者的筛选条件苛刻，导致大量患者无法接受TIL疗法，还会损失大量的原始TIL细胞导致最终获得的TIL细胞数量减少；其二是因为长期处于肿瘤细胞营造的免疫抑制环境中， TIL细胞的增殖能力受到了严重的抑制从而导致最终获得的TIL细胞数量减少。本发明针对上述两个问题，提供了一种自体癌性胸腹水来源的肿瘤浸润 T淋巴细胞的扩增方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种自体癌性胸腹水来源的肿瘤浸润T淋巴细胞的扩增方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种自体癌性胸腹水来源的肿瘤浸润T淋巴细胞的扩增方法，包括以下步骤：

S1、自体胸腹水的采集：无菌收集患者自体胸腹水，离心，收集细胞沉淀；

S2、待分选样本的准备：加入分选缓冲液对步骤S1收集的细胞沉淀进行吹打冲洗，接着离心，去除上清，再加入分选缓冲液对细胞沉淀进行重悬，得到细胞悬液，对细胞悬液进行细胞计数，根据计数结果通过加入分选缓冲液对细胞悬液进行处理，得到细胞悬液反应液；

S3、分选磁珠的添加：向步骤S2得到的细胞悬液反应液中加入分选磁珠，混合均匀，于2-4℃孵育15-20min，孵育结束后，得到混合物；

S4、洗脱和上样：向步骤S3得到的混合物中加入分选缓冲液进行洗脱，洗脱完成后，弃掉上清后，用分选缓冲液将总细胞浓度调整为1.5-2×10^8/ml，得到细胞磁珠混合悬液，然后进行上样操作；