[发明专利]一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法及应用

说明书

本发明涉及一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法，涉及生物技术领域，包括以下步骤：羊膜组织的处理；羊膜上皮细胞的培养；羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备。上述制备方法操作简单、成本较低且可控性强，羊膜上皮细胞外泌体能显著增加化疗损伤卵巢卵泡数量，抑制化疗药物诱导的卵巢急性血管损伤及颗粒细胞凋亡，部分抑制化疗药物诱导的原始卵泡激活，因此可用于修复化疗损伤后的卵巢功能、减轻化疗药物对卵巢的损伤、防治化疗药物引起的卵巢早衰或防治化疗引起的不孕不育。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法及应用。

背景技术

源于胎盘羊膜组织，表达干细胞标志分子及相关基因，但不表达端粒酶基因，具有非致瘤性，同种异体移植后不发生免疫排斥反应，同时还可分泌免疫抑制因子，防止移植后炎性反应的发生，因此可以看作是免疫赦免细胞。羊膜上皮细胞具有多能干细胞特性和向三胚层细胞分化的潜能，免疫原性低，移植后无致瘤性，伦理道德问题少，取材方便、来源丰富、是细胞治疗较理想的种子细胞来源。

羊膜上皮细胞胶原海绵复合体不同过静脉注射，也无需手术，操作难度小，可由患者在家独立完成，风险相对较小且CK-19、bFGF、Nanog、GFAP、mRNA、Nestin表达均呈上调趋势，其中Nestin表达上调的差异有统计学意义。

羊膜上皮细胞胶原海绵复合体是一种具有生物活性的填塞物，其保存环境要求高，效期短，目前的保存想达到最佳的治疗效果，仍然只能采取个性化预定的模式。另外，部分对胶原蛋白过敏的患者可能会引起局部的过敏反应。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

本发明解决技术问题采用如下技术方案：

本发明提供了一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法，包括以下步骤：

S1、将足月健康产妇的羊膜组织用手术剪剪下后收集到离心管中；

S2、用生理盐水漂洗3遍；

S3、用手术剪将羊膜组织剪成靡状；

S4、按1：1的比例加入0.25％胰酶消化30min；

S5、加入胰酶等体积的完全培养基终止消化；

S6、200目滤网过滤收集滤液到新的离心管中；

S7、1500rpm/min离心10分钟，去上清；

S8、完全培养基重悬沉淀，接种到培养瓶培养，3天换液一次；

S9、当细胞融合度达到70％-80％时，等体积完全培养基终止消化，离心去上清，完全培养基重悬沉淀，接种到培养瓶中5％CO2，37℃培养；

S10、将胶原海绵平铺于D15cm培养皿中，加入30ml完全培养基充分浸润备用；

S11、待S9中细胞融合度达到70％-80％时，用0.25％胰酶消化贴壁细胞2-3min，等体积完全培养基终止消化，离心去上清，完全培养基重悬沉淀，接种到S10中浸润好的胶原海绵培养皿中5％CO2，37℃培养，4天后收集胶原海绵为羊膜上皮细胞胶原海绵复合体。

优选地，所述S8接种到培养瓶中4-6％CO₂，35-38℃培养。

优选地，所述S9细胞融合度达到70％-80％时，用0.25％胰酶消化贴壁细胞2-3min。

优选地，所述完全培养基配方为：Hyclone MEMα95％+HELIOS血替5％。