[发明专利]一种诱导和富集光感受器前体细胞的方法

说明书

本发明公开了一种诱导和富集光感受器前体细胞的方法。该方法基于将光感受前体的标记基因BLIMP1与GFP融合的策略，在人多能干细胞中构建BLIMP1‑EGFP报告系统，基于3D视网膜类器官诱导产生荧光标记的光感受器前体细胞，并通过流式细胞术分选富集，提高光感受器前体细胞的丰度并用于细胞移植实验。同时，本专发明发现IGF1‑PHLDA1‑PAKT信号轴的激活可促进光感受器前体细胞的产量和活性，IGF1和MK2206可增加人视网膜类器官中光感受器前体细胞的产量和活性，用于高效诱导产生可供移植治疗的视网膜前体细胞。

技术领域

本发明涉及干细胞生物学领域，具体涉及一种诱导和富集光感受器前体细胞的方法。

背景技术

光感受器前体细胞作为视觉形成的第一个环节，通过接受光将其转换为神经信号，并传递至神经节细胞、外膝状体细胞，最终到达视觉皮层形成视觉。在哺乳动物中，光感受器前体细胞分为视锥和视杆细胞，视锥细胞主要负责强光视觉、颜色感知等，而视杆细胞负责弱光下视觉形成。

随着医疗行业的发展，白内障以及角膜等致盲疾病以及得到了有效的治疗方式，但是视网膜退行性病变做为不可逆的疾病，目前仍然没有有效的治疗和干预手段。随着社会经济水平的发展，糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑病变等致盲疾病的发病率逐渐上升，这些疾病致盲的最终因素都是导致光感受器前体细胞退行性病变，而光感受器前体细胞作为终末分化的神经元细胞，其退行性病变是无法逆转和修复的。

近年来，iPSC(诱导性多能干细胞)分化的细胞在治疗多种疾病中具有优良的治疗效果，如利用iPSC衍生的神经元替代疗法治疗帕金森综合征。因此，iPSC衍生的光感受器前体细胞的替代疗法可以作为一种光感受器退行性病变的有效治疗手段。然而，在光感受器前体细胞发育过程中，光感受器前体细胞占比较低，且缺乏明确的光感受器前体细胞的表面标记物，无法有效的获取其中的光感受器前体细胞，导致可用于移植的前体细胞的数量限制。同时，由于缺乏有效的体内示踪方法，移植后的细胞的存活和命运无法有效系统评估，妨碍了移植再生治疗方法的发展和临床转化。

现有技术针对光感受器退行性病变的治疗方案主要为：1.混合所有的视网膜类器官细胞进行移植。2.利用CRX等基因标记光感受器细胞，通过流式细胞仪筛选出所有的光感受器细胞进行移植。然而，上述技术方案存在以下缺点：1.在发育阶段，光感受器细胞占所有细胞类型的比例较低，采用所有的视网膜类器官细胞存在不特异、高成本、整合效率低等问题。2.CRX标记所有发育阶段的光感受器细胞、无法区分光感受器前体细胞。3.暂缺乏有效增加、富集光感受器前体细胞的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服光感受器前体细胞来源少，无法富集的现状，提供高效的光感受器前体细胞富集策略，并为光感受器移植后的示踪和疗效评估提供技术方法。

为实现上述目标，本研究采取的技术方案为：

首先，构建BLIMP1-EGFP报告干细胞系。本发明利用BLIMP1(PRDM1)仅在光感受器前体细胞中表达这一特征，通过CRISPR-Cas9技术将EGFP和BLIMP1基因融合，从而可以通过EGFP在视网膜类器官中示踪BLIMP1表达，并通过流式细胞仪特异性富集视网膜类器官中的光感受器前体细胞。EGFP在光感受器前体细胞成熟后不表达，具有良好的生物安全性。

其次，增加视网膜类器官中光感受器前体细胞的比例。本发明首次发现IGF1-PHLDA1-PAKT信号轴的激活可促进光感受器前体细胞的产量和活性，利用PHLDA1促进光感受器细胞分化这一特征，在培养基中添加IGF1(insulin-like growth factor 1，胰岛素样生长因子1)以及AKT抑制剂(MK2206小分子化合物)促进视网膜干细胞向光感受器前体细胞分化，利用流式细胞仪筛选GFP阳性细胞获得光感受器前体细胞。

因此，本发明的第一个目的是提供一种诱导和富集光感受器前体细胞的方法，其包括以下步骤：