[发明专利]一种诱导和富集光感受器前体细胞的方法

权利要求书

1.一种诱导和富集光感受器前体细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用CRISPR-Cas9技术将EGFP基因插入到干细胞的BLIMP1基因座中，构建BLIMP1-EGFP报告干细胞系；

(2)对BLIMP1-EGFP报告干细胞系进行传代培养，然后使用视网膜诱导液诱导干细胞分化为3D视网膜类器官；

(3)在干细胞向3D视网膜类器官分化期间，往视网膜诱导液中加入IGF1和/或AKT抑制剂进行处理，特异增加其中的光感受器前体细胞数量；

(4)加入消化液将视网膜类器官解离为单细胞悬液，利用流式细胞分选仪，根据内源表达的EGFP筛选出光感受器前体细胞，收集光感受器前体细胞的单细胞悬液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的干细胞为hESC或iPSC。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的光感受器前体细胞包括视锥和视杆前体细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，特异性增加视锥前体细胞的处理条件为：在干细胞向3D视网膜类器官分化的第30-80天，往视网膜诱导液中加入IGF1和/或AKT抑制剂进行处理；特异性增加视杆前体细胞的处理条件为：在干细胞向3D视网膜类器官分化的第80-110天，往视网膜诱导液中加入IGF1和/或AKT抑制剂进行处理。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述的IGF1的处理条件为50ng/mL处理1-2周，所述的AKT抑制剂的处理条件为0.5～1μM处理1-2周。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的IGF1的处理条件为50ng/mL处理2周，所述的AKT抑制剂的处理条件为1μM处理2周。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的AKT抑制剂为MK2206。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的视网膜诱导液的配方为：基础培养基+2％B27+1％非必需氨基酸+1％抗生素+2mM谷氨酰胺+10％胎牛血清+0.5mM视黄酸+100mM牛磺酸；所述的基础培养基为DMEM/F12按3:1体积比的混合物。

9.IGF1和/或AKT抑制剂在增加和富集光感受器前体细胞中的应用。

10.BLIMP1-EGFP报告的hESC或iPSC干细胞系在增加和富集光感受器前体细胞中的应用。