[发明专利]一种基于色相变化的免疫层析试纸条及使用方法

说明书

本发明提供一种基于色相变化的免疫层析试纸条及使用方法。本发明的免疫层析试纸条的测试线上固定绿色荧光微球和抗体1，结合垫喷涂抗体2修饰的红色荧光微球；检测病原菌的主要原理为：待测病原菌特征基因经核酸扩增后产生的特异产物激活CRISPR/Cas12a的侧切活性，导致抗原1和抗原2标记的ssDNA断裂，使其流经试纸条测试线时无法固定红色荧光微球，测试线呈绿色；无目标病原菌的样品因无法激活CRISPR/Cas12a，不能切割ssDNA，红色荧光微球偶联ssDNA，并通过抗体1识别ssDNA上的抗原1而被固定在测试线上，使测试线呈红色；根据测试线颜色过渡变化，可肉眼判别目标病原菌的含量，实现半定量检测。

技术领域

本发明属于食品安全与品质检测领域，具体涉及一种基于色相变化的免疫层析试纸条及使用方法。

背景技术

食源性疾病是世界范围内的一个重要公共卫生问题。大约91％的食源性疾病是由细菌污染引起的。沙门氏菌属、弯曲杆菌属、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和致病性大肠杆菌是导致食品相关疫情数量最多的主要病原体。世界各地国家及组织也已经将食品安全防控的焦点从调查食源性疾病暴发后的原因逐渐转移至主动检测和预防食品污染。食品安全检测方法需要更加快速、简便和准确。

核酸检测在临床诊断、基因编辑、大流行疾病预防以及各种生物医学研究中至关重要。聚合酶链反应(Polymerase chain reaction)是最早的，也是目前最流行的扩增和检测低丰度核酸的扩增技术。虽然PCR已广泛应用于各个领域，但它需要精密且昂贵的热循环仪，这在很大程度上限制了PCR在资源有限的环境和即时检测(POC)分析中的应用。为了满足在条件受限的环境下信号放大的需求，已经开发了多种等温核酸扩增方法，如重组酶聚合酶扩增 (RPA)、滚环扩增(RCA)、环介导等温扩增(LAMP)、以及链置换扩增(SDA)等。这些等温扩增方法因操作简单、具有较快扩增速度、高灵敏度和选择性、并且能在低温和恒定温度下操作而引起广泛关注。但是，在扩增过程中，二聚体与非靶扩增子的形成等非特异性现象会造成假阳性结果，因而寻找一种高特异性识别靶序列的分析方法是非常有必要的。

基于聚类规则间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats，CRISPR)相关核酸酶(Cas)检测是一种很有前景的核酸检测新方法。已有很多工作报道，Cas效应蛋白被用作高度特异性的序列识别元件，与等温扩增技术相联用，结合不同的信号读取方式进行现场检测，极大提高了核酸检测的特异性和准确度。目前，基于 CRISPR/Cas12a结合等温扩增较为常见的信号输出的方式有：(1)被靶标激活的Cas12a无差别切割荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA在紫外激发下产生荧光信号；(2)利用Cas12a 切割ssDNA，结合AuNPs的局部表面等离子共振现象实现颜色变化；(3)切割电化学活性物标记的DNA探针实现电化学信号输出；(4)结合侧流层析试纸条上测试线和质控线显色变化实现肉眼可视读取。其中，侧流层析试纸条具有易于携带、性价比高、使用方便、反应速度快等优点，在现场检测领域得到了广泛的应用。但是，目前已报道的用于与CRISPR/Cas结合使用的侧流层析试纸条研究中，测试线信号大多是通过anti-FITC标记的信号探针(AuNPs、QBs等)捕获FITC-ssDNA-Biotin得以呈现，测试线信号呈“Turn off”模式—与竞争法侧流层析试纸条分析结果类似。但是“Turn off”比“Turn on”信号输出模式灵敏度低，并且不利于对结果进行判读和理解。为了解决这一问题，许多工作将质控线(C线)、测试线位置对调，使得测试线信号呈“Turn on”模式，但是存在的问题是：1)需确保没有靶标出现时，结合垫上的探针刚好完全被质控线(原测试线)捕获，靶标出现时ssDNA被剪断，释放探针被测试线(原质控线)捕获，从而才能呈现Turn on”模式，这无疑增大试纸条研发期间的工作量。2)质控线和测试线位置的调换易给非专业人员带来逻辑上的理解障碍，易造成结果的误判。此外，胶体金作为侧流层析试纸条常用的一种信号探针，存在灵敏度低和难以定量的问题，这也是在实际应用急需解决的一大问题。