[发明专利]一种木蝴蝶种子促铁内生真菌的分离方法及其应用

说明书

本发明公开了一种木蝴蝶种子促铁内生真菌的分离方法及其应用，其中分离方法主要包括：S1：种子预处理；S2：内生真菌分离；S3：菌株ITS序列鉴定；S4：菌株产铁载体活性测定；将分离得出的载铁能力最强的促铁内生真菌Penicilliumochrochloron接种至黄豆幼苗，经实验验证木蝴蝶种子中分离的促铁内生真菌对黄豆对铁的转运吸收具有明显的促进作用；对研究内生菌促进植物铁吸收研究具有重要的意义。

技术领域

本发明属于真菌分离及其应用技术领域，具体涉及一种木蝴蝶种子促铁内生真菌的分离方法及其应用。

背景技术

木蝴蝶是《中国药典》收录的一味临床常用中药，性味苦、甘、凉，具有清肺、利咽、止咳、疏肝等多种药用作用。现如今关于药用植物内生菌的研究越来越多，但目前对木蝴蝶的研究主要集中在药理学方面，研究表明木蝴蝶具有抗氧化、抗菌、抗炎、镇痛、抗癌、降糖、抗诱变等多种生物活性；木蝴蝶果实在成熟过程中，果实颜色由绿色转为紫色，推测铁含量可能增加；

植物内生真菌可以通过产生植物激素、有机酸、铁载体、裂解酶等物质直接或间接的促进植物生长，铁载体的产生对铁具有很高的亲和力，能够通过铁螯合来促进植物的生长；作为辅酶因子和电子传递链关键组分，铁参与了植物光合作用、呼吸作用、氣固定、氨基酸合成等多种重要的生理代谢过程；

植物内部具有复杂的铁转运机制，包括铁螯合剂(烟胺、柠檬酸盐、麦根酸家族)，以及这些螯合剂、铁螯合物或游离铁离子的各种转运体。烟酰胺作为辅酶酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH/NAD⁺)的主要前体，在细胞中参与NAD⁺和NADP⁺的合成，参与各种酶促氧化还原反应以产生能量，如糖酵解、三羧酸循环和电子传输链等。麦根酸类物质(Mugineic acid，MA)是植物最常见的铁载体，其合成途径已初步明确。L-甲硫氨酸(L-Methionine,L-Met)是麦根酸合成的前体，首先在S-腺苷基甲硫氨酸合成酶(Sadenosylmethionine synthase,SAMS)的催化下生成S-腺苷基甲硫蛋氨酸 (S-adenosyl-L-methionine,SAM)，然后再烟胺合成酶(Nicotianamine synthase,NAS)的作用下生成烟胺(Nicotianamine,NA)，之后通过烟胺氨基转移酶(Nicotianamine aminotransferase,NAAT)催化生成麦根酸的3'-酮基中间产物，最后由脱氧麦根酸合成酶 (2'-Deoxymugineic acid synthase,DMAS)催化生成2'-脱氧麦根酸 (2'-Deoxymugineic acid,DMA)；DMA是第一个合成的麦根酸，它进一步转化为麦根酸(MA)、阿凡酸(Avenic acid,AVA)、基麦根酸(3-Hydroxymugineic acid,HMA)、3-表-基麦根酸 (3-Epi-hydroxy-mugineic acid,ep-iHMA)等麦根酸类植物铁载体。根系细胞内形成的MAs被输出转运蛋白OsTOM1和OsTOM2 (Transporter ofmugineic acidfamilyphytosiderophores)运输到细胞外整合游离的Fe³⁺形成Fe³⁺-MAs整合物并被植物吸收利用。

当微生物检测到低铁环境时会分泌铁载体来获取铁，铁载体清除并结合Fe³⁺，形成铁-铁载体复合物，与特异性受体结合后运输到细胞质膜，最后通过ABC转运系统跨膜运输到细胞质。每种真菌都有 ABC转运蛋白，目前的研究清楚地表明，ABC蛋白在ATP水解时，运输参与不同代谢途径的各种底物和提供对抗真菌化合物的耐受甚至抵抗的外源物质，或参与细胞生存所必需的过程，如拟南芥根中合成的次级代谢物东莨菪素，可通过ABCG37转运蛋白运输，在根系对铁的吸收过程中发挥重要作用。我们的研究发现筛选出的16种差异代谢物质富集到该通路，其中Spermidine、Putrescine、L-Proline 富集到参与矿质离子转运的通路，且在该通路中表达上调。