[发明专利]一种木蝴蝶种子促铁内生真菌的分离方法及其应用

权利要求书

1.一种木蝴蝶种子促铁内生真菌的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：种子预处理：采集成熟紫色木蝴蝶果实，剥离出新鲜健康饱满的木蝴蝶种子，清除表面泥沙后用超声清洗；

S2：内生真菌分离：对木蝴蝶种子进行消毒，消毒后分割成小块，接种至PDA固体培养基平板上，置于恒温培养箱中倒置培养同时进行消毒灭菌；培养过程中，将新生的菌丝挑取尖端部分转接至新的培养基上，将纯化完成的菌株转接至斜面培养基2～4℃保存；

S3：菌株ITS序列鉴定：将分离的内生真菌菌株挑取少量接种于PDA培养基上，25～28℃培养至菌落量足以刮取；无菌环境下进行菌落刮取，提取DNA进行测序；

S4：菌株产铁载体活性测定：取供试菌株发酵液用0.45um的微孔滤膜过滤除菌后与CAS检测液振荡混匀；静止后测定其OD630As以纯水作为对照调零，用相同方法测定未接菌株的无铁查氏液体培养基的对照样品的吸光值Ar作为参比值；铁载体的浓度用铁载体活性单位SU表示，

SU＝[(Ar-As)/Ar]×100％

重复测算3次；分离得到木蝴蝶种子促铁真菌菌株Penicillium ochrochloron载铁能力最强。

2.根据权利要求1所述一种木蝴蝶种子促铁内生真菌的分离方法，其特征在于，所述S3中选择ITS4和ITS5真菌特异性引物对提取的内生菌DNA进行PCR扩增；PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，进行测序，测序结果提交NCBI的GeneBank，BLAST比对进行同源性分析，利用MEGA11软件绘制进化树，确定内生菌株的内分类学地位。

3.根据权利要求1所述一种木蝴蝶种子促铁内生真菌的分离方法，其特征在于，所述供试菌株发酵液与CAS检测液体积比为1:1。

4.根据权利要求1所述一种木蝴蝶种子促铁内生真菌的分离方法，其特征在于，公开了分离得到的木蝴蝶种子促铁真菌Penicillium ochrochloron在促进黄豆铁转运吸收中的应用。

5.根据权利要求4所述一种木蝴蝶种子促铁内生真菌的分离方法，其特征在于，所述应用方法为：

S1：菌液制备：选取分离出的载铁能力最佳的木蝴蝶种子促铁内生真菌菌株，取菌饼接种于PDB液体培养基，置于恒温振荡培养箱，培养5～7d后，振荡打碎，搅拌均匀备用；

S2：黄豆种子处理：挑选颗粒饱满的黄豆浸泡于2％次氯酸钠溶液进行表面灭菌；用无菌水冲洗干净后温水浸种15～20min；将灭菌处理的黄豆均匀铺放在装有无菌水浸湿的无菌滤纸的灭菌培养皿中，暗培养至种子露白；

S3：真菌接种：将催芽的黄豆播种于灭菌的育苗基质上，选取长势健康的幼苗接种木蝴蝶种子促铁内生真菌。

6.根据权利要求5所述一种木蝴蝶种子促铁内生真菌的分离方法，其特征在于，所述育苗基质由以下成分组成：营养土、珍珠岩、蛭石；其比例为2:1:1。

7.根据权利要求5所述一种木蝴蝶种子促铁内生真菌的分离方法，其特征在于，所述木蝴蝶种子促铁内生真菌接种方式为每20d接种一次，接种2次。