[发明专利]一种纯化融合蛋白的方法

说明书

本发明提供了一种纯化融合蛋白的方法，包括以下步骤：步骤1，处理层析填料，上样；步骤2，使用平衡缓冲液淋洗；步骤3，使用洗脱缓冲液洗脱产品，并收集产品。本发明通过改进纯化条件，对添加剂种类、添加剂浓度、洗脱pH的考量和筛选，得到了合适的纯化工艺，使得融合蛋白中去除多聚体的效果较好，最终得到了纯度高、稳定性好的融合蛋白，有利于提高产品的质量控制水平、药物稳定性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种有效提纯多功能融合蛋白，减少多聚体杂质的纯化工艺。

背景技术

多聚体是指抗体蛋白以二聚体或多聚体形式存在的聚集体。多聚体主要在细胞培养、蛋白纯化、制剂处方和药物储存的工艺过程中由于受培养工艺、纯化条件以及制剂存储过程中某些因素的影响，从而导致蛋白质部分分解折叠或者错误折叠，暴露的相关区域相互作用引发聚集，形成多聚体。

多聚体不仅可能会使得药物活性降低甚至失去生物活性，从而影响药效，更有可能使得受体发生过敏性免疫原反应，从而影响了受体的健康。因此，多聚体是抗体蛋白类药物在制备过程中需要监控和去除的杂质，药物中的多聚体含量被认为是产品的一个重要的质量指标。

在抗体融合蛋白药物生产的过程中，虽然我们可以通过改变操作条件，来控制多聚体的产生，但是我们没有办法达到产品中完全没有多聚体的控制效果。所以有效的多聚体的去除手段对于多聚体的控制就显得至关重要。

目前抗体融合蛋白类药物去除多聚体的纯化工艺，主要包括凝胶过滤层析、亲和层析、离子层析和疏水层析，其中亲和层析作为最主要的纯化方法，在洗脱过程中最常用的是线性洗脱法。一般的线性洗脱法的效果优于等度洗脱法。然而，线性洗脱法也存在一定的弊端，由于涉及到产品的分管收集，在生产过程中收集产品繁琐，可操作性不高。另外，在实际生产过程中，线性梯度的条件也不容易操作，导致不适合工业化生产。

发明内容

为了克服这一技术难题，本发明对抗体融合蛋白的纯化工艺进行了优化，在洗脱步骤中考察了不同的层析填料，不同的洗脱方式，不同的洗脱缓冲液对去除多聚体的影响，筛选出了合适的添加剂种类、添加剂浓度和最优的洗脱pH，最终开发出了最优的等度洗脱法，从而筛选出了合适的纯化工艺，使得在融合蛋白中去除多聚体的效果显著提高，且操作简单，适合工业化生产。

具体而言，本发明公开了一种纯化融合蛋白的方法，包括以下步骤：

步骤1，处理层析填料，上样；

步骤2，使用平衡缓冲液淋洗；

步骤3，使用洗脱缓冲液洗脱产品，并收集产品。

进一步地，所述洗脱缓冲液包含NaAc-HAc、Tris-盐酸、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液中的一种或几种。

进一步地，所述洗脱缓冲液还包含添加剂。

进一步地，所述添加剂选自氨基酸、醇、糖、盐中的一种或多种。

进一步地，所述氨基酸为精氨酸、甘氨酸、组氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸中的一种或几种。

进一步地，所述盐选自NaCl和CaCl₂的一种或两种。

进一步地，所述添加剂的浓度为10-200mM，优选为20-100mM，更优选为30-80mM，进一步优选为40mM、50mM、60mM或70mM。

进一步地，所述洗脱方法为等度洗脱法或线性洗脱法。

进一步地，所述洗脱方法为等度洗脱法。

进一步地，所述洗脱缓冲液包含洗脱缓冲液1和洗脱缓冲液2。

进一步地，所述洗脱缓冲液1的pH为3.0-5.0，优选为3.5-4.5，更优选为3.9-4.1，进一步优选为3.9、4.0或4.1。