[发明专利]一种用于肝纤维化治疗的生物人工肝处理血清制备方法

说明书

本发明公开了一种用于肝纤维化治疗的生物人工肝处理血清制备方法，属于医疗领域，包括以下步骤：S1：种入肝细胞和脐带间充质干细胞；S2：将血浆离心去除血细胞，并用0.2μm的低蛋白吸附滤器过滤去除细胞碎片及杂质，得到肝纤维化血浆；S3：将纤维化血浆与F12细胞培养基以重量比为2:1的比例混合，将得到的液体灌注进入所述竖置板恒流式生物人工肝反应器进行循环处理；S4：收集纤维化血浆和F12细胞培养基的混合液，并用0.2μm的低蛋白吸附滤器过滤去除细胞碎片，得到治疗血清。本发明具有患者个体化，使用便捷，纤维化治疗效果显著等优势，能够为肝纤维化临床治疗提供全新的解决方案。

技术领域

本发明是关于医疗领域，特别是关于一种用于肝纤维化治疗的生物人工肝处理血清制备方法。

背景技术

肝纤维化是由慢性肝损伤导致的一种复杂的瘢痕形成以及持续炎症反应的病理状态。发达国家主要病因是感染丙型肝炎病毒、酗酒，以及非酒精性肝病。亚洲地区则以乙型肝炎病毒感染为主要原因。中国是感染HBV最多的国家，约有9000万人患有慢性乙型肝炎感染，估计每年有30万例HBV相关死亡。肝脏纤维化的不断进展将不断破坏肝脏正常结构，致使肝脏代谢能力下降，门静脉血流阻力增加，最终会发展为肝硬化并伴发门静脉高压症、肝性脑病及肝功能衰竭，并导致肝细胞癌的风险增加。目前肝纤维化尚无有效且安全性高的临床治疗方法。因此，另辟蹊径获取有效且安全性高的肝脏纤维化治疗方法是非常迫切的，同时也能够在上游阻断大部分的肝衰竭状态的发生。

肝纤维化为中国带来巨大医疗负担，由于其迁延发展，最终将会诱导肝功能衰竭或肝癌的发生。现并无有效临床治疗方法。

现有人工肝的临床治疗均面向急性肝衰竭治疗。血浆灌流或血浆置换为最基本的两种方式。血浆灌流为通过动静脉置管建立体外循环通路，引出并分离血浆通过反应器装置，处理后再进行回输。血浆灌流能够将血浆直接引入生物反应器中处理再回输至患者体内，但治疗持续时间较长，需6-24h循环治疗方能达到治疗效果，这也限制了生物人工肝系统通过血浆灌流的方式进行临床应用。血浆置换为分离患者血浆，同时将获取健康个体中获取等量替代血浆回输至患者体内实现治疗效果。此种方式会导致替代血浆的大量消耗，临床应用受到血浆短缺的限制。

生物人工肝的基本原理是在特殊的生物反应器内进行肝细胞或者组织的培养，利用体外循环装置将肝衰竭患者血液或血浆引人生物反应器内，通过反应器内的半透膜与肝细胞进行物质交换和生物作用。生物型人工肝功能的主要影响因素在于生物反应器中的细胞来源以及细胞培养方式的选择，原代肝细胞体外扩增困难，功能难以维持，因此多采用肝癌细胞系或者猪肝细胞作为主要生物材料。培养方式包括平板、悬浮或是支架培养，依据培养方式的不同可分为支架型、悬浮型以及平板单层型生物人工肝。支架型通过建立纤维支架，为干细胞提供复杂粘附环境，促进三维结构的形成；悬浮型通过搅动或低粘附环境促进细胞自发聚集形成球形体，促进细胞间相互接触；平板型则通过将细胞铺覆于平面或纤维纺丝平面上进行培养。

现有生物人工肝包括国外的AMC-BAL系统、SRBAL系统以及中国的李氏系统、丁氏系统以及兰州大学第一医院李汛课题组新型生物反应器系统等。AMC-BAL系统采用具有氧气输送纤维以及用于小量聚集肝细胞三维培养的螺旋缠绕无纺聚酯纤维支架，将猪肝细胞注入反应器后，细胞将在缠绕的纤维支架之间形成三维结构继而发挥功能。SRBAL系统是将猪肝细胞进行悬浮震荡培养，由细胞表面分子如E-钙粘蛋白介导的细胞间粘附形成肝细胞球，将患者血浆分离后导入含有肝细胞球的生物反应器以发挥功能。李氏系统以使用无纺布为猪肝细胞提供附着，以中空纤维为血流管道进行物质交换，血浆分离后先经由物理过滤器(活性炭、树脂等)过滤，后通过中空纤维内部，经由纤维管壁渗透与壁外猪肝细胞接触，而后血浆与血细胞重建血液返回患者体内，临床试验疗效良好。丁氏系统采用多层平板培养方式，使用静电纺丝技术在使平板铺覆一层壳聚糖纳米纤维支架，将肝样细胞与骨髓间充质干细胞进行播种共培养，肝样细胞在纳米纤维表面粘附形成小的聚集体，实现肝功能的表达。兰州大学第一医院李汛课题组新型生物反应器系统则创新利用竖置板恒流器方式在生物反应器内建立适宜流体剪切力促进肝细胞功能，同时结合肝细胞与非实质细胞共培养技术进一步提升反应器“肝功能”。