[发明专利]一种高产槐糖脂的基因敲除工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种高产槐糖脂的基因敲除工程菌，其特征在于：所述工程菌以熊蜂生假丝酵母菌为出发菌株，用gF-Hph-gR核苷酸序列取代槐糖脂合成路径中调控内酯化反应的基因序列seq2；

其中，所述gF-Hph-gR核苷酸序列为SEQ ID No.1，所述seq2基因序列为SEQ ID No.2。

2.一种高产槐糖脂的基因敲除工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、构建敲除盒；

S2、制备野生型熊蜂生假丝酵母菌感受态细胞及转化结果验证。

3.根据权利要求2所述的一种高产槐糖脂的基因敲除工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中，包含如下步骤：

A1、优化带有强启动子和终止子的潮霉素抗性基因gF-Hph-gR；

A2、将gF-Hph-gR核苷酸序列插入pUC57质粒，构建得到潮霉素筛选标记质粒pUHP；

A3、使用高保真酶，以熊蜂生假丝酵母菌基因组DNA为模板，以SBLEdl F1/SBLEdl R1为模板，扩增seq2基因序列；再以seq2基因序列为模板，分别用引物SBLEdl F2/SBLEdl R2和SBLEdl F4/SBLEdl R4扩增seq2基因的上下游同源臂序列5’flanking和3’flanking；

A4、以潮霉素筛选标记质粒pUHP为模板，用引物SBLEdl F3/SBLEdl R3，扩增得到两端分别带有seq2基因上游和下游20bp同源序列的潮霉素高效表达盒gF-Hph-gR；

A5、切胶纯化得到seq2基因上下游同源臂5’flanking和3’flanking，切胶纯化带有同源序列的潮霉素高效表达盒gF-Hph-gR；

A6、融合pcr：将纯化得到的3条基因进行融合，最终获得线性seq2基因敲除盒。

4.根据权利要求3所述的一种高产槐糖脂的基因敲除工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤A2中，引物SBLEdl F1/SBLEdl R1的序列如SEQ ID No.5/SEQ ID No.6所示，引物SBLEdl F2/SBLEdl R2的序列如SEQ ID No.7/SEQ ID No.8所示，引物SBLEdl F4/SBLEdlR4的序列如SEQ ID No.9/SEQ ID No.10所示，引物SBLEdl F3/SBLEdl R3的序列如SEQ IDNo.11/SEQ ID No.12所示。

5.根据权利要求3所述的一种高产槐糖脂的基因敲除工程菌的构建方法，其特征在于：带有同源序列的潮霉素基因线性表达盒的5’端和3’端同源序列分别如SEQ ID No.3-1和SEQ ID No.3-2所示。

6.根据权利要求2所述的一种高产槐糖脂的基因敲除工程菌的构建方法，其特征在于：所述步骤S2中，将线性seq2基因敲除盒转化进感受态细胞，经转化处理的感受态细胞涂布在含有潮霉素的YPD平板上培养，挑选平板上正常生长的菌落进行YPD液体培养,提取所述菌落基因组DNA；以提取的基因组DNA为模板，使用Premix Taq酶，以SBLEdl F2/SBLEdl R4为引物，根据PCR扩增得到的DNA片段长度判断转化结果。

7.一株高产槐糖脂的基因敲除工程菌的应用，其特征在于，所述工程菌在在发酵生产槐糖脂中的应用。

8.根据权利要求7所述的一种高产槐糖脂的基因敲除工程菌的应用，其特征在于，所述发酵生产槐糖脂的步骤如下：

B1、将工程菌接种到装有5mLYPD种子培养基的试管中培养；

B2、将种子液按2％(v/v)的接种量接种到含50mLYPD培养基的摇瓶中进行一级摇瓶发酵；

B3、待OD₆₀₀＝1.0，再以5％(v/v)的接种量接种到含100mL发酵培养基的500mL摇瓶中培养5～10天。