[发明专利]一种L-泛解酸内酯水解酶的固定化方法

说明书

本发明提供一种L‑泛解酸内酯水解酶的固定化方法，包括如下步骤：将含有镍离子的固定载体与携带组氨酸标签的L‑泛解酸内酯水解酶混合，孵育，得到含有固定化的L‑泛解酸内酯水解酶的溶液。本发明的方法操作简单、固定化效率高，得到的固定化L‑泛解酸内酯水解酶活性高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种L-泛解酸内酯水解酶的固定化方法。

背景技术

D-泛酸存在于植物以及低等生物的代谢过程中，或称本多酸，是水溶性维生素B族的一种。目前D-泛酸在生物体内的代谢途径已经确定，即经α-酮异戊酸，利用酮泛解酸羟甲基转移酶生成酮泛解酸，再利用酮泛解酸还原酶形成泛解酸，最后与β-丙氨酸形成D-泛酸。

D-泛解酸内酯是合成D-泛酸的重要中间体。化学法合成D-泛解酸内酯常常从羟醛缩合开始，利用廉价的异丁醛和甲醛进行合成，该工艺已经非常成熟。异丁醛与甲醛在碱性、高温条件下羟醛缩合形成羟基特戊醛，再添加氢氰酸，在酸性条件下进行醇氰化反应形成氰醇；氰醇在酸性条件下通过水解环化得到DL-泛解酸内酯；外消旋的内酯利用化学手性拆分剂或对映异构体过量结晶分离出D-泛解酸内酯和L-泛解酸内酯；L-泛解酸内酯经过化学内消旋化再形成DL-泛解酸内酯，重复利用。动力学拆分中D-泛解酸内酯的理论收率可达100％。工业生产中常采用化学酶法合成D-泛解酸内酯，即以甲醛和异丁醛为起始原料，经醛缩合、腈化及内酯化等反应生成DL-泛解酸内酯，再经L-泛解酸内酯水解酶选择性拆分得到D-泛解酸内酯。

生物酶是一种高效的生物催化剂，催化作用具有效率高、耗能低、反应产物无污染等特点。但是游离酶对外界的环境很敏感，在反复冻融、存在有机溶剂、高温及存放时间过长等情况下极易失活。上世纪60年代，固定化方法开始被慢慢发现，即利用一些特殊的方法将目的蛋白固定在相应的载体上，制备成固定化酶，这种酶与载体结合的形式可以对酶分子实现多次重复利用，对环境的适应性将大幅度提升，因而具有广阔的应用前景。常见的酶固定化方法有以下几种：吸附法，利用静电吸引力和范德华力将酶分子和载体结合在一起；共价结合法，通过载体上面的化学基团与酶上面的基团如氨基等结合形成共价键实现固定化；包埋法，将酶分子包裹在特殊的天然或人工合成的生物大分子中，常用的材料如卡拉胶、聚丙烯酰胺等；交联法，采用戊二醛或京尼平等交联剂用其官能团将载体与酶结合形成共价键，理论上来说比共价结合法多了交联剂的使用，获得的固定化酶相比于共价结合酶来说更加牢固。

目前，国内针对L-泛解酸内酯水解酶的高效固定化方法还未见报道。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种L-泛解酸内酯水解酶的固定化方法，该方法通过使用含有特定金属离子的固定载体固定化含有组氨酸标签的L-泛解酸内酯水解酶，利用特定金属离子与组氨酸标签之间较强的结合作用，将L-泛解酸内酯水解酶固定在磁性纳米载体上。本发明的方法固定化效率高，适合该类酶的固定化应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种L-泛解酸内酯水解酶的固定化方法，包括如下步骤：

将含有镍离子的固定载体与携带组氨酸标签的L-泛解酸内酯水解酶混合，孵育，得到含有固定化的L-泛解酸内酯水解酶的溶液。

根据本发明的一些实施方式，所述固定载体是磁性纳米颗粒。优选地，所述磁性纳米颗粒包括铁磁体。在一些优选实施方式中，所述磁性纳米颗粒的制备包括如下步骤：