[发明专利]羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定和开发应用

说明书

本发明涉及纳米抗体技术领域，具体为羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定和开发应用，包括：蛋白提取，所述血样用UA裂解法提取蛋白质，所述采用BCA进行蛋白质定量；蛋白溶液内酶解，所述血样中蛋白质酶解后采用MCX对肽段进行脱盐，肽段冻干后加入40μL0.1％甲酸溶液复溶，肽段定量，质谱上机，所述质谱上机采用纳升级流速HPLC液相系统Easy nLC进行分离，所述样品上样到色谱柱Thermo scientific EASY column，再经分析柱分离。本发明在骆驼和羊驼血液中均鉴定到了纳米抗体，且纳米抗体的表达量存在差异，可以看出骆驼中纳米抗体的表达量远大于羊驼，这说明骆驼可以更容易获取到纳米抗体，可以将骆驼作为提取天然纳米抗体的主要来源。

技术领域

本发明涉及纳米抗体技术领域，具体为羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定和开发应用。

背景技术

纳米抗体是缺失轻链的天然重链抗体的可变区组成的单域抗体，与传统抗体相比具有相对分子质量小(约15kDA)、亲和力高、特异性强、稳定性高、体内组织渗透性好以及人源化简单等特点。

纳米抗体可以作为疾病诊断与检测的工具，同时纳米抗体药物也具有广阔的发展前景。但快速稳定的分离出高亲和力的抗体是很难实现的。纳米抗体相对分子质量小仅为常规抗体的1/10左右，因常规的蛋白组学方法会损失一些低丰度信号，所以无法鉴定到纳米抗体。而4D-labelfree是新一代蛋白质组学分析技术，在鉴定准度、鉴定深度、定量准确性、检测周期等性能上有了全面的提升，因此定性和定量数据更稳定，可以准确的鉴定到小分子物质。现今大多数纳米抗体的制备都是通过在骆驼体内分离出重链抗体，经PCR扩增获得全套重链抗体可变区基因，而后将其克隆至载体，而后在体外表达获得纳米抗体库，骆驼和羊驼同属于骆驼科且体内均存在纳米抗体，因常规蛋白组学方法无法检测到分子量小的纳米抗体，所以目前并没有其在动物体内表达量的研究，因此亟需设计羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定和开发应用来解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定和开发应用，以解决上述背景技术中提出的骆驼和羊驼同属于骆驼科且体内均存在纳米抗体，因常规蛋白组学方法无法检测到分子量小的纳米抗体，所以目前并没有其在动物体内表达量的研究的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案，羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定，包括：

蛋白提取，

所述血样用UA(8MUrea，100mMTris/HCl，pH8.5)裂解法提取蛋白质，所述采用BCA(Bio-Rad，USA)进行蛋白质定量；

蛋白溶液内酶解，

所述血样裂解后采用MCX(MCXuElutionPlate30um)对肽段进行脱盐，肽段冻干后加入40μL0.1％甲酸溶液复溶，肽段定量(OD280)；

质谱上机，

所述质谱上机采用纳升级流速HPLC液相系统EasynLC进行分离，所述样品上样到色谱柱ThermoscientificEASYcolumn(2cm*100μm5μm-C18)，再经分析柱ThermoscientificEASYcolumn(75μm*100mm3μm-C18)分离，流速为300nL/min，肽段经色谱分离后使用timsTOFPro质谱仪(4D-labelfree)进行质谱分析；

查库，

所述质谱分析原始数据为采用Peaks软件进行查库鉴定及定量分析；

纳米抗体及相关肽段的鉴定，

所述骆驼血液中鉴定到了2种纳米抗体，所述羊驼血液中鉴定到1种纳米抗体。