[发明专利]羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定和开发应用

权利要求书

1.羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定，其特征在于，包括：

蛋白提取，

所述血样用UA(8MUrea，100mMTris/HCl，pH8.5)裂解法提取蛋白质，所述采用BCA(Bio-Rad，USA)进行蛋白质定量；

蛋白溶液内酶解，

所述血样中蛋白质酶解后采用MCX(MCXuElutionPlate30um)对肽段进行脱盐，肽段冻干后加入40μL0.1％甲酸溶液复溶，肽段定量(OD280)；

质谱上机，

所述质谱上机采用纳升级流速HPLC液相系统Easy nLC进行分离，所述样品上样到色谱柱Thermo scientific EASYcolumn(2cm*100μm5μm-C18)，再经分析柱Thermo scientificEASY column(75μm*100mm3μm-C18)分离，流速为300nL/min，肽段经色谱分离后使用timsTOF Pro质谱仪(4D-labelfree)进行质谱分析；

查库，

所述质谱分析的原始数据采用Peaks软件进行查库鉴定及定量分析；

纳米抗体及相关肽段的鉴定，

所述骆驼血液中鉴定到了2种纳米抗体，所述羊驼血液中鉴定到1种纳米抗体。

2.根据权利要求1所述的羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定，其特征在于：所述血样裂解后的样品每个取20μg蛋白分别与5Xloading buffer混合，煮沸5min，在12.5％的SDS-PAGE凝胶上(恒流14mA，90min)分离，考马斯亮蓝R-250染色显示蛋白条带。

3.根据权利要求1所述的羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定，其特征在于：所述血样裂解的各样品取200μg蛋白质，加入8MUA，室温1h，加入DTT至终浓度为100mM，600rpm震荡1min，室温孵育1h，加入IAA buffer(50mMIAAinUA)，600rpm振荡1min，室温避光反应30min。加入100mM NH4HCO3溶液，将8M UA稀释至2M。加入40μL Trypsin buffer(4μg Trypsin in40μL 25mM NH4HCO3)，600rpm振荡1min，37℃放置16-18h，加入TFA酸化，调pH至3左右。

4.根据权利要求1所述的羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定，其特征在于：所述缓冲液成分为:A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)，色谱柱以95％的A液平衡，所述缓冲液相关液相梯度如下:1小时梯度:0min-50min，B液线性梯度从0％-35％；50min-55min，B液线性梯度从35％-100％；55min-60min，B液维持在100％。

5.根据权利要求1所述的羊驼和骆驼血液中纳米抗体的提取鉴定，其特征在于：所述质谱上机时长为60min，且检测方式为正离子，离子源电压设置为1.5kV，MS及MSMS均用TOF进行检测和分析，所述质谱扫描范围设置为100-1700m/z，所述数据采集模式采用平行累积串行碎裂(PASEF)模式，一张一级质谱采集后进行10次PASEF模式采集母离子，一个循环窗口时间为1.17秒。电荷数在0-5范围内的二级谱图，串联质谱扫描的动态排除时间设置为24秒避免母离子的重复扫描。

6.羊驼和骆驼血液中纳米抗体的开发应用，其特征在于：所述骆驼和羊驼血液中均鉴定到了纳米抗体，且纳米抗体的表达量存在差异，所述骆驼中纳米抗体的表达量远大于羊驼，所述骆驼可以更容易获取到纳米抗体，所述将骆驼作为提取天然纳米抗体的主要来源。