[发明专利]一种利用山乌龟愈伤组织生产千金藤素的方法

说明书

本发明涉及千金藤素生产技术领域，具体涉及一种利用山乌龟愈伤组织生产千金藤素的方法，具体包括以下步骤，选取千金藤素含量高于0.5%的山乌龟植株地上茎段作为外植体，外植体清洁与消毒，愈伤组织诱导培养，将愈伤组织转移至增值及千金藤素积累培养基中，所述增值及千金藤素积累培养基为改良MS+2,4‑D0.2～0.5mg/L+MET 1.0～1.2mg/L+MeJA 10.0～12.0μmol/L+Ala 15～20mg/L+山乌龟块根酶解液5～10ml/L，所述改良MS元素成分不变，糖添加量调整为50～55g/L，pH调整为6.2，增值及千金藤素积累培养后，取出愈伤组织，然后进行干燥、提取获得千金藤素，通过本发明的技术方案，极大的缩短了千金藤素的生物积累周期，可一方面可利于保护山乌龟野生药材的采挖，另一方面有利于在短时间内解决千金藤素的需求。

技术领域

本发明涉及千金藤素生产技术领域，具体涉及一种利用山乌龟愈伤组织生产千金藤素的方法。

背景技术

山乌龟，泛指防己科千金藤属（Stephania）所有多年生草质藤本植物，以地下块根入药，其内含罗痛定，盐酸异紫堇定，千金藤素，防己碱等40余种生物碱类，其中罗痛定为甲类非处方药罗通定片的主要成分，而千金藤素是千金藤素片的主要成分，有清热凉血的功效，主要用于肿瘤病人因放化疗引起的白细胞减少症。而主要含千金藤素的山乌龟普遍存在有效成分含量低，单株生物量小，其他近似生物碱种类繁多引起分离高纯度千金藤素难度大等问题,且山乌龟栽培和种植耗时长,从而无法满足市场对千金藤素的需求。

发明内容

针对千金藤素现有产业技术的不足，特发明了一种利用高含量山乌龟植株，诱导愈伤组织，并沟通过愈伤组织的增殖培养时，同步进行千金藤素的积累，最终获可用于提取千金藤素的愈伤组织。

为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：

一种利用山乌龟愈伤组织生产千金藤素的方法，包括以下步骤：

S1：选取千金藤素含量高的山乌龟品种的地上茎段作为外植体；

S2：外植体清洁与消毒；

S3：愈伤组织诱导培养；

S4：将愈伤组织转移至增殖及千金藤素积累培养基中，所述增殖及千金藤素积累培养基为改良MS+2,4-D0.2～0.5mg/L+MET（多效唑） 1.0～1.2mg/L+MeJA（茉莉酸甲酯）10.0～12.0μmol/L+Ala（丙氨酸）15～20mg/L+山乌龟块根酶解液5～10ml/L，所述改良MS元素成分不变，糖添加量调整为50～55g/L，pH调整为6.2；

S5：增殖及千金藤素积累培养后，取出愈伤组织，然后进行干燥、提取获得千金藤素。

进一步的，所述步骤S2中，外植体消毒方法为：用75%酒精消毒15～20s后用无菌水涮洗3～4次，再用0.1%升汞溶液消毒6～7min后用无菌水涮洗6～7次，优选的，诱导培养条件为：温度25±2℃，每日照光10h，光强2000～3000lx的光暗交替环境培养。

进一步的，所述步骤S3中，愈伤组织诱导培养基为：MS+2,4-D 0.5～0.8mg/L+6-BA0.5～0.8mg/L+CPPU 0.02～0.04mg/L。

进一步的，步骤S4中，增殖及千金藤素积累培养方法为：在温度25±2℃，每日照光12h，光强2000～3000lx的光暗交替环境下培养15天至愈伤明显变大后，增加光强至4000～5000lx，并调整每日光照14h，照光时温度为28±2℃，后进行暗培养，温度降为18～20℃，并在此环境下培养40天。

进一步的，步骤S4中，山乌龟块根酶解液的制备方法为：取10g山乌龟新鲜块根，切碎后加入1L水，并加入50mg果胶酶，pH调到3.0，用超声机在45±2℃下超声30min，过滤获得的澄清液。

本发明的有益效果在于：