[发明专利]一种猪成纤维细胞培养方法

说明书

本发明公开了一种猪成纤维细胞培养方法，包括以下步骤：剪取猪耳组织，加入0.1％胶原蛋白酶消化液将耳组织充分剪碎至匀浆，后将其转移至已加0.1％的胶原蛋白酶消化液的离心管中消化；加入DMEM终止消化，并反复吹打数次至组织块充分散开为单细胞，过滤，离心，弃去上清液，收集细胞沉淀；在细胞沉淀中加入培养基重悬细胞，接种至培养皿中，将培养皿放入培养箱中培养，去除培养基，清洗，再加入培养基，继续培养，获得猪成纤维细胞。本发明利用胶原蛋白酶分离猪耳组织，避免了现有技术中37℃条件下胰蛋白酶水解对细胞表面蛋白质的破坏，避免了细胞损伤。收获的成纤维细胞成活率高，贴壁率高，繁殖力增强，有利于猪种质资源的保存。

技术领域

本发明属于成纤维细胞培养技术领域，具体涉及一种猪成纤维细胞培养方法。

背景技术

虽然我国有许多优秀的畜禽品种资源，但是有许多地方种产量较低，为了满足人们对优质的动物产品的需求，我国引入了外国高产的畜牧品种，与我国地方低产品种交配繁衍后代，以此提高我国的畜牧业生产水平。这一方法虽然达成了目的，提高了畜牧产品的产量，但是使某些地方品种被杂交种取代，导致地方种数量大幅度下降甚至濒临灭绝。以猪种资源为例，我国许多地方猪种由于与外来猪种杂交，导致纯种种群数量急剧下降，甚至濒临灭绝。

为了更好的保存优秀畜类的种质资源，可以采用体细胞保存技术。目前体细胞保存技术已经较为成熟。其方法为取优良畜类的组织细胞，通过组织培养技术，来获得成纤维细胞，然后进行保存。根据培养的组织细胞特点，可以采用酶消化法或是组织块贴壁法，这两种培养方法都能体外培养动物细胞，组织块贴壁法虽然操作简单，但是存在组织块贴附不牢的不足。在酶消化法中，细胞不仅受到机械应力，还会受到胰蛋白酶水解的影响，导致细胞产生损伤，变得不易贴壁或者贴壁时间延长，影响细胞的活力和繁殖力。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种猪成纤维细胞培养方法。

为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

提供一种猪成纤维细胞培养方法，包括以下步骤：

(1)选取猪耳部血管较少的耳边缘组织，清洗、剪取大小为1cm²的耳组织，浸泡、冲洗、保存；

(2)在超净工作台上刮去耳组织表面的毛及污染物，用含5％双抗的PBS清洗20-30次；

(3)加入1mL 0.1％胶原蛋白酶消化液将耳组织充分剪碎至匀浆，将剪碎后的耳组织匀浆转移至已加1mL 0.1％的胶原蛋白酶消化液的15mL离心管中，放入37℃水浴锅中，每隔5min震荡一次，全过程消化时间2h；

(4)加入9mL含2％FBS的DMEM终止消化，并反复吹打数次至组织块充分散开为单细胞，过滤，离心，弃去上清液，收集细胞沉淀；

(5)在细胞沉淀中加入2mL培养基，吹打混匀后过滤，加入2mL培养基混匀后，离心，弃去上清液，收集细胞沉淀；

(6)在细胞沉淀中加入10mL培养基重悬细胞，接种至10cm的培养皿中，将培养皿放入培养箱中培养30min后，去除培养基，用含3％双抗的PBS清洗2次，加入10mL培养基，继续培养，获得猪成纤维细胞。

进一步地，步骤(1)的具体方法为：选取猪耳部血管较少的耳边缘组织，先用含有5％双抗的生理盐水充分冲洗耳朵，再用酒精棉球充分擦拭3-4次去掉表面的污染物，然后用手术刀片或剪刀取下大小1cm²的耳组织，立即放入75％酒精中浸泡1分钟，然后用含有5％抗生素的生理盐水冲洗3遍，放入含5％双抗的DMEM组织保存液中。

进一步地，步骤(3)中，0.1％胶原蛋白酶消化液的制备方法为：取100mg胶原蛋白酶粉末，加入由79mL DMEM培养液、20mL PBS缓冲液和1mL双抗组成的混合溶液中，搅拌使其混合均匀，置于4℃环境内放置一夜，第二天将胶原蛋白酶溶液放在超净台内，抽滤除菌，-20℃下冻存。