[发明专利]一种猪成纤维细胞培养方法在审
| 申请号： | 202211254708.0 | 申请日： | 2022-10-13 |
| 公开（公告）号： | CN115418345A | 公开（公告）日： | 2022-12-02 |
| 发明（设计）人： | 胡诚军;彭维祺;冀凤杰;吕仁龙;荣光;周汉林 | 申请（专利权）人： | 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 |
| 主分类号： | C12N5/077 | 分类号： | C12N5/077 |
| 代理公司： | 成都宏田知识产权代理事务所(普通合伙) 51337 | 代理人： | 徐鹏 |
| 地址： | 571700 *** | 国省代码： | 海南;46 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 种猪 纤维 细胞培养 方法 | ||
1.一种猪成纤维细胞培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选取猪耳部血管较少的耳边缘组织，清洗、剪取大小为1cm2的耳组织，浸泡、冲洗、保存；
(2)在超净工作台上刮去耳组织表面的毛及污染物，用含5％双抗的PBS清洗20-30次；
(3)加入1mL 0.1％胶原蛋白酶消化液将耳组织充分剪碎至匀浆，将剪碎后的耳组织匀浆转移至已加1mL 0.1％的胶原蛋白酶消化液的15mL离心管中，放入37℃水浴锅中，每隔5min震荡一次，全过程消化时间2h；
(4)加入9mL含2％FBS的DMEM终止消化，并反复吹打数次至组织块充分散开为单细胞，过滤，离心，弃去上清液，收集细胞沉淀；
(5)在细胞沉淀中加入2mL培养基，吹打混匀后过滤，加入2mL培养基混匀后，离心，弃去上清液，收集细胞沉淀；
(6)在细胞沉淀中加入10mL培养基重悬细胞，接种至10cm的培养皿中，将培养皿放入培养箱中培养30min后，去除培养基，用含3％双抗的PBS清洗2次，加入10mL培养基，继续培养，获得猪成纤维细胞。
2.根据权利要求1所述的猪成纤维细胞培养方法，其特征在于，步骤(1)的具体方法为：选取猪耳部血管较少的耳边缘组织，先用含有5％双抗的生理盐水充分冲洗耳朵，再用酒精棉球充分擦拭3-4次去掉表面的污染物，然后用手术刀片或剪刀取下大小1cm2的耳组织，立即放入75％酒精中浸泡1分钟，然后用含有5％抗生素的生理盐水冲洗3遍，放入含5％双抗的DMEM组织保存液中。
3.根据权利要求1所述的猪成纤维细胞培养方法，其特征在于，步骤(3)中，0.1％胶原蛋白酶消化液的制备方法为：取100mg胶原蛋白酶粉末，加入由79mL DMEM培养液、20mL PBS缓冲液和1mL双抗组成的混合溶液中，搅拌使其混合均匀，置于4℃环境内放置一夜，第二天将胶原蛋白酶溶液放在超净台内，抽滤除菌，-20℃下冻存。
4.根据权利要求1所述的猪成纤维细胞培养方法，其特征在于，步骤(4)中，过滤条件为：100μm过滤筛过滤。
5.根据权利要求1所述的猪成纤维细胞培养方法，其特征在于，步骤(4)和步骤(5)中的离心条件为：1500rpm，离心5min。
6.根据权利要求1所述的猪成纤维细胞培养方法，其特征在于，步骤(5)中，过滤条件为：40μm过滤筛过滤。
7.根据权利要求1所述的猪成纤维细胞培养方法，其特征在于，步骤(5)和步骤(6)中，培养基均为含10％FBS，3％双抗的培养基。
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