[发明专利]一种Ⅺ型新城疫病毒（F48E9）的重组拯救病毒制备方法、重组病毒及应用

说明书

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种Ⅺ型新城疫病毒(F48E9)的重组拯救病毒制备方法、重组病毒及应用。通过建立Ⅺ型新城疫病毒F48E9株的反向遗传操作系统，将反向遗传系统中全长基因组P基因进行定点氨基酸突变，并对其全长NDV基因组cDNA拯救，获救出Ⅺ型新城疫病毒P蛋白突变毒株rF48E9/P(R386A)、rF48E9/P(K387A)，这两株重组病毒毒力明显减弱，同时在鸡胚上具有高滴度、遗传性能稳定，对动物无致病能力，为新一代新城疫疫苗的开发提供了技术支持。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其一种Ⅺ型新城疫病毒(F48E9)的重组拯救病毒制备方法、重组病毒及应用。

背景技术

新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的一种禽类呼吸道、消化道和神经系统损伤为主要特征的急性、高度致死性传染病。NDV为单股负链RNA病毒，属于副黏病毒科、禽副黏病毒属。NDV只有一个血清型，但存在不同的基因型。根据致病性，NDV被分为四种不同的毒株：速发嗜内脏型新城疫病毒，速发嗜神经型新城疫病毒，中发新城疫病毒与缓发无症状肠道新城疫病毒。NDV基因组总大小为15186、15192或15198bp，其基因编码包括核蛋白(nucleoprotein,NP)，磷蛋白(phosphoprotein,P)，基质蛋白(matrix protein，M)，融合蛋白(fusion protein,F)，血凝素神经氨酸酶(hemagglutinin-nueraminidase,HN)和大聚合酶蛋白(RNA-dependent RNApolymerase or large ploymerase，L)在内的6个结构蛋白，以及两个非结构蛋白V和W。基因组以3’-NP-P-M-F-HN-L-5’顺序排列。

病毒L和P蛋白构成的病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase,RdRp)及NP蛋白和病毒基因组RNA构成的核衣壳(nucleoprotein complex,NC)组成了病毒核糖核蛋白(RNP)复合物，是NDV复制的基本单位。其中，P蛋白共有395个氨基酸，特定的氨基酸残基上出现磷酸化，导致其分子量大小从50～55kDa不等，不同的磷酸化形式在其形成同源寡聚体中发挥作用。P蛋白C端有32个氨基酸(316～347位氨基酸)和N端59个氨基酸形成超螺旋结构，是L-P、P-P、P-NP之间互作的主要区域。P基因的转录可通过RNA编辑产生辅助蛋白V蛋白和W蛋白。RNP复合物中起桥梁作用的P蛋白对于病毒基因组的复制和转录有着不可或缺的作用。同时，P蛋白可与宿主蛋白相互作用，调控病毒复制。但目前有关P蛋白与病毒毒力关系的报道较少，NDV基因序列的结构和功能以及毒株进化有待进一步研究，以便于为新一代新城疫疫苗的开发提供技术支持。

发明内容

本发明提供了一种Ⅺ型新城疫病毒(F48E9)的重组拯救病毒制备方法、重组病毒及应用，通过建立Ⅺ型新城疫病毒F48E9株的反向遗传操作系统，将反向遗传系统中全长基因组中的P基因进行定点氨基酸突变，并对其全长NDV基因组cDNA拯救，获救出Ⅺ型新城疫病毒P蛋白突变毒株rF48E9/P(R386A)、rF48E9/P(K387A)，这两株重组病毒毒力明显减弱，同时在鸡胚上具有高滴度、遗传性能稳定、对动物无致病能力，为新一代新城疫疫苗的开发提供技术支持，解决了现有技术中存在的问题。

本发明所采用的技术方案之一是：

一种Ⅺ型新城疫病毒(F48E9)的重组拯救病毒制备方法，包括如下操作步骤：

(1)Ⅺ型新城疫病毒(F48E9)基因组全长cDNA转录载体的构建：

在质粒pBR322中构建了Ⅺ型NDV F48E9毒株基因组的全长cDNA，质粒命名为pBR322-rF48E9；

(2)Ⅺ型新城疫病毒反向遗传系统的建立：