[发明专利]弥补OsLOX3敲除水稻株抗瘟性降低及验证方法和应用

说明书

本发明涉及农业生物基因工程技术领域，具体来说是一种弥补OsLOX3敲除水稻株抗瘟性降低及验证方法和应用，生长至三叶一心期的OsLOX3敲除水稻株，按100株水稻喷施15～20mL浓度为100ppm的外源苯丙氨酸溶液，24h取样测定亚麻酸和亚油酸含量；生长至三叶一心期的OsLOX3敲除水稻株感染稻瘟菌36～48h时，按前述方式外源苯丙氨酸溶液；喷施后于接种稻瘟菌的36h、48h、72h和96h时取样，测定JA响应、防御、SA信号、活性氧和POD基因相对表达量；喷施后于接种稻瘟菌168h后进行病害调查。本发明方法弥补OsLOX3敲除水稻株抗瘟性降低的方法使得防治时间更为精确，并且做到安全有效，为水稻种质资源利用与保护提供重要的措施。

技术领域

本发明涉及农业生物基因工程技术领域，具体来说是一种弥补OsLOX3敲除水稻株抗瘟性降低的方法及其应用。

背景技术

植物激素等活性小分子物质在调控植物生长发育和环境胁迫响应中具有重要作用，是植物应对环境刺激时首先响应的“看门狗”，可使植物将有限资源分配到响应最具生命威胁的胁迫中，使各种胁迫响应得以权衡，从而将复杂过程有序化，茉莉酸(JA)作为多个植物激素中的核心组分，参与多个植物激素信号共同调节植物生长发育和胁迫响应，例如JA能够从多方面增强水稻对植物病原真菌、细菌和病毒的抗性。有研究表明OsLOX3主要参与亚麻酸转化为13-hydroperoxide，而亚麻酸是茉莉酸的合成前体。因此OsLOX3不仅参与茉莉酸合成还参与病原菌侵染时的防御响应。为了阐明OsLOX3敲除水稻株的抗性以及OsLOX3在JA合成和防御响应中的作用，进一步揭示OsLOX3介导的JA合成和抗瘟性的调控机制，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术将水稻中的OsLOX3基因敲除获得OsLOX3敲除水稻株，已有大量研究表明，OsLOX3作为防御相关基因，敲除后会导致水稻抗性降低，但其水稻品质却明显改善，主要表现在OsLOX3敲除水稻株中亚麻酸和亚油酸含量较高，而且OsLOX3敲除水稻株发芽率显著提高，同时转录组分析发现OsLOX3敲除水稻株中芳香族氨基酸的生物合成/代谢/催化过程中的基因下调，意味着OsLOX3敲除水稻株中苯丙氨酸等一类芳香族氨基酸含量降低，而这类氨基酸在植物抗性中发挥重要作用。

本发明提出了一种弥补OsLOX3敲除水稻株抗性降低的方法及验证方法，即外源喷施苯丙氨酸(Phe)。虽然外源苯丙氨酸处理植物提高抗性的方法很多，并且都能有效减轻植物病害的发病程度，但对于苯丙氨酸处理水稻，特别处理OsLOX3敲除转基因水稻提高其抗瘟性的方法还没有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种弥补OsLOX3敲除水稻株抗瘟性降低的方法及其应用，以解决背景技术中存在的问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：弥补OsLOX3敲除水稻株抗瘟性降低的方法，步骤包括：

(1)生长至三叶一心期的OsLOX3敲除水稻株，按100株水稻喷施15～20mL浓度为100ppm的外源苯丙氨酸溶液，24h取样测定亚麻酸和亚油酸含量；

(2)生长至三叶一心期的OsLOX3敲除水稻株感染稻瘟菌36～48h时，按100株水稻喷施15～20mL浓度为100ppm的外源苯丙氨酸溶液；

(3)步骤(2)喷施后于接种稻瘟菌的36h、48h、72h和96h时取样，测定JA响应基因、防御基因、SA信号基因、活性氧基因和POD基因相对表达量；

(4)步骤(2)喷施后于接种稻瘟菌168h后进行病害调查。

进一步的，步骤(2)中，所述感染稻瘟菌的时间为48h。

进一步的，步骤(2)中，所述稻瘟菌的菌株为95234I-1b。

进一步的，所述稻瘟菌的菌株孢子悬浮液的浓度为1×10⁵个/mL。