[发明专利]一种来自黄曲霉的嗜热烯还原酶、表达载体及其应用

说明书

本发明属于酶催化领域，涉及一种工程菌，特别是指一种来自黄曲霉的嗜热烯还原酶、表达载体及其应用。发明提供了一种来自黄曲霉的新型嗜热烯还原酶AfOYE1，并建立该酶的过表达体系，获得过表达AfOYE1的大肠杆菌细胞，构建了AfOYE1酶催化碳碳双键不对称还原制备手性烷烃的方法。将来自黄曲霉中被标注为AfvA的基因克隆至表达载体获得重组载体pETDuet‑gdh‑afoye1，并将所述重组载体转化大肠杆菌获得重组细胞，以所述重组细胞为催化介质，将烯烃催化还原为手性烷烃。

技术领域

本发明属于酶催化领域，涉及一种工程菌，特别是指一种来自黄曲霉的嗜热烯还原酶、表达载体及其应用。

背景技术

不对称还原碳碳双键C=C反应生成手性烷烃是合成许多药物、农药和材料的关键步骤，该催化过程可以得到含有一个或者两个手性中心的化合物。目前使用的化学催化C=C不对称还原过程需要采用氢气和昂贵的手性配体及过渡金属催化剂，因此存在操作过程危险和成本高等不足(Dong Wang; Didier Astruc; The Golden Age of TransferHydrogenation. Chemical Reviews 2015, 115(13), 6621-6686.)。

酶催化碳碳双键不对称还原具有催化条件温和、专一性高、过程控制简单等优点，因而被广泛的应用于手性烷烃的制备。专利202010195210.6中公开了一种烯还原酶突变体该突变体对于特定的底物：式中R为H、OH、COOH等基团，在60 ℃时的半衰期仅为4h。另外，已知的嗜热烯还原酶的催化活性较低，如自枯草芽孢杆菌的嗜热烯还原酶YqiG催化不同烯烃（5 mol/L）反应24小时后，其转化率低于60%（Christin Peters;David Frasson; Martin Sievers; Rebecca Buller; Novel Old Yellow EnzymeSubclasses.Chembiochem2019,20(12), 1569-1577.）。在实际工业生产应用中，较高的反应温度为工业应用过程所必须的，如通过提高温度以增加底物的溶解度及提高反应速率等，因此开发新型高活性的嗜热烯还原酶对于酶催化碳碳双键不对称还原制备手性烷烃的工业应用非常关键。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提出一种来自黄曲霉的嗜热烯还原酶、表达载体及其应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种来自黄曲霉的嗜热烯还原酶（AfOYE1），其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

包含上述的嗜热烯还原酶的核苷酸序列的表达载体。

上述表达载体还含有编码葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列。

一种催化剂，含有上述的表达载体。

上述的催化剂在高温催化碳碳双键不对称还原制备手性烷烃中的应用，包括以下步骤：

1）合成AfOYE1基因，并将所述AfOYE1基因插入到含有葡萄糖脱氢酶的pETDuet-gdh载体的多克隆位点，获得表达载体pETDuet-gdh-afoye1；

2）将表达载体pETDuet-gdh-afoye1转入大肠杆菌，获得表达AfOYE1酶和葡萄糖脱氢酶的重组载体；

3）用磷酸盐缓冲液将所述重组载体配制成5-20 g/L的菌悬液；

4）将菌悬液、D-葡萄糖和底物混合获得反应体系，180-240 rpm震荡反应2-48 h，反应结束后，采用乙酸乙酯萃取（2×20 mL），收集有机相，经无水硫酸钠干燥、过滤、蒸出溶剂获得粗产物，再采用石油醚和乙酸乙酯的体积比为50:1的溶液为流动相，硅胶（200-300目）柱层析获得目标产物；其中D-葡萄糖为10 g/L；底物在反应体中的浓度为1-10 g/L。