[发明专利]一种慢病毒高效感染人NK细胞的方法

说明书

本发明属于生物医药领域，具体是一种慢病毒高效感染人NK细胞的方法。所述方法包括使用携带目标基因的病毒对NK细胞进行两次病毒感染的步骤，第一次病毒感染时加入polybrene，第二次病毒感染时加入PMA、IONOMYCIN、polybrene、IL‑2。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体是一种慢病毒高效感染人NK细胞的方法。

背景技术

作为固有免疫系统的重要成员，自然杀伤(natural killer，NK)细胞是机体抗击病毒感染及肿瘤的第一道防线。基于NK细胞MHC非限制性、泛特异性识别和杀伤靶细胞及快速应答的特点，嵌合抗原受体自然杀伤细胞(chimeric antigen receptor naturalkiller cell，CAR-NK)在血液肿瘤免疫治疗的应用方面被寄予越来越多的关注和期待。嵌合抗原受体(CAR)是一种受体蛋白，它赋予免疫细胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。新近的临床研究及临床前研究结果均提示CAR-NK细胞对于AML、淋巴瘤、MM等恶性血液肿瘤具有较强的抗肿瘤效应且不良反应较小，未来作为细胞免疫治疗拥有良好的前景及研究价值。

肿瘤细胞可通过免疫逃逸机制逃避NK细胞攻击而限制了NK细胞的临床应用，CAR-NK细胞可通过反转录病毒及慢病毒转染表达胞外抗原识别区而克服其免疫逃逸缺陷。但因NK细胞仅占外周血淋巴细胞的15％左右、体外扩增培养技术仍不成熟、DNA转染效率低等技术瓶颈，临床应用方案等研究仍远远落后于T细胞。

目前CAR基因转染的两大系统主要是无病毒的转座子基因转染系统和基于慢病毒、反转录病毒的转染体系。原代NK细胞利用病毒转染体系的效率仅约15％，且反转录病毒转染可能会引起插入突变，外周血来源的NK细胞采用慢病毒转染效率亦很低。慢病毒与逆转录病毒不同，它不需要主动分裂细胞，因此能够转导更多类型的NK细胞，因此比逆转录病毒转导具有一些潜在的优势。

原代NK细胞的慢病毒转导效率通常依赖于促进病毒进入的化学试剂，如阳离子聚丙稀烯和鱼精蛋白硫酸盐。然而，这些试剂已经显示出对NK-92细胞的毒性，因此替代试剂，如DEAE-葡聚糖和多聚-L-赖氨酸，近年来也被使用。此外，无毒的阳离子多肽，如维甲酸，已被用于转染造血干细胞来源的NK细胞，并显示出比化学试剂更高的转染效率。

发明内容

为解决现有的病毒感染NK细胞效率很低，且感染后细胞活率低的技术问题，本发明提供一种高效的慢病毒高效感染人NK细胞的方法。

本发明的技术方案包括：

第一方面，本发明提供了一种将目标基因导入NK细胞的方法，所述方法包括两次病毒感染的步骤，第一次病毒感染时加入polybrene，第二次病毒感染时加入PMA、IONOMYCIN、polybrene、IL-2，所述病毒携带目标基因。

优选地，所述polybrene的工作浓度是8μg/ml。

优选地，所述PMA的工作浓度是1μg/ml。

优选地，所述IONOMYCIN的工作浓度是0.25μg/ml。

优选地，所述IL-2的工作浓度是150ng/ml。

优选地，所述第一次病毒感染时的病毒复数是3-5MOI；最优选地，所述第一次病毒感染时的病毒复数是4MOI。

优选地，所述第二次病毒感染时的病毒复数是5-7MOI；最优选地，所述第二次病毒感染时的病毒复数是6MOI。

优选地，所述第一次病毒感染的持续时间是1-3小时；最优选地，2小时。

优选地，所述第二次病毒感染的持续时间是3-5小时；最优选地，4小时。

优选地，所述病毒是慢病毒(Lentivirus)。