[发明专利]通过荧光免疫层析检测技术测定单克隆抗体亲和力的方法

说明书

本发明涉及一种通过荧光免疫层析检测技术测定单克隆抗体亲和力的方法，包括以下步骤：S1：制备荧光标记物并标记待测抗体，获得荧光标记抗体溶液；S2：抗原与羊抗鸡IgY分别包被在硝酸纤维素膜上的检测线与质控线；S3：稀释抗原，建立梯度稀释的抗原溶液；稀释好的抗原溶液分别加入荧光标记抗体溶液，混匀后静置，获得混合物；S4：将步骤S3中获得的混合物进行反应测试并获得测试结果；S5：对测试结果进行数据处理，获得拟合曲线，计算获得抗体的解离常数，其倒数即为抗体的亲和力常数数值。该通过荧光免疫层析检测技术测定单克隆抗体亲和力的方法能用于快速评价抗体亲和力，避免因为抗体效价不足而丢失高亲和力抗体。

技术领域

本发明涉及荧光免疫检测技术领域，涉及一种通过荧光免疫层析检测技术测定单克隆抗体亲和力的方法。

背景技术

荧光免疫层析，荧光免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型。

抗体亲和力，抗体亲和力是指抗体与抗原表位或抗原决定簇之间的结合力，本质是一种非共价作用力，包含了对氨基酸之间的吸引力，氢键、疏水性作用力等。抗体亲和力大小可以用亲和力常数KD(升/质量摩尔浓度)表示，计算公式为：KD＝[Ab·H]/([Ab][H])其中[]表示摩尔浓度，Ab表示抗体，H表示半抗原，Ab·H表示抗体与半抗原的结合物。亲和力常数KD越高，则抗体结合半抗原的能力越强。抗体亲和力的强弱取决于抗体对位与所用抗原表位之间的配合程度，包括接触面积的大小、亲和程度以及带点基团与疏水基因的分布等。抗体亲和力体现了一个抗体分子和抗原分子或半抗原的一个决定簇起反应的能力，是评价抗体质量的重要指标，反应了抗体与相应抗原之间的结合力度。亲和力越高，抗体与相应的抗原之间的结合程度越高，对抗体的应用具有重要的指导作用。

目前，常用的亲和力测定方法有酶联免疫吸附实验、表面等离子共振法、生物膜干涉技术和固相放射免疫法等。其中，酶联免疫吸附实验，ELISA的灵敏度很高，利用ELISA可以测出10^-8M数量级的亲和力常数，可以满足一般抗体亲和力的测定需要。且ELISA无需对抗原或抗体进行标记，操作简便易行，是目前常用的亲和力测定方法。但是对于检测二抗的灵敏度要求较高。表面等离子共振法(SPR)测定抗体亲和力是基于表面等离子共振技术建立的一种亲和力测定技术。只需按照仪器说明对进行操作，在加好样品后，便可以得到亲和力常数。相较于竞争ELISA法，SPR法测定抗体亲和力有诸多优势，如可以实时监测反应的动态过程，实验结果重现性好、仪器记录的数据不能随意更改，减少了主观因素的影响、实验的重复性更好等，缺陷是成本较高。生物膜干涉技术，根据生物膜干涉技术(BLI)，可利用Fortebio检测仪器对抗体亲和力进行测定的原理为：生物传感器底端由固定的相互作用分子组成的生物膜层覆盖，当具有一定带宽的可见光垂直入射生物膜层时，光在生物膜层的两个界面反射后形成被光谱仪检测到的一定波长的干涉波。固定分子与溶液中分子发生相互作用时，生物层厚度增加，干涉光谱曲线向波长增加的方向移动，相位移动由工作站探测并分析，可定量得出传感器表面分子数量变化及相关浓度与动力学数据；但同样成本较高。固相放射免疫法，固相放射免疫法可以比较准确的测出抗体亲和力常数，其操作步骤为：用抗原(如病毒颗粒或蛋白质)包被微板，加入系列稀释的定量单克隆抗体。温育至反应平衡后，洗去未结合的单克隆抗体加放射性同位素标记的抗小鼠lg第二抗体，温育后洗涤，将小孔割下计数结合的放射性强度。只要保持包被抗原量恒定，即可按公式([Ab]a/[Ab]r-[Ab]B)/(Ab)a＝-nK。其中[Ab]a为结合抗体浓度，[Ab]r为总抗体浓度，n为抗体结合价，K为亲和力常数。缺陷是操作较为复杂，对于操作人员的要求及实验条件要求较高。