[发明专利]一种竞争型中华鲟促黄体生成素检测试剂盒及应用

权利要求书

1.一种竞争型中华鲟促黄体生成素检测试剂盒，其特征在于，包括中华鲟LH抗体、中华鲟LH蛋白标准品和LH示踪剂；

所述中华鲟LH抗体为中华鲟重组LHβ蛋白经动物免疫后获得的多克隆抗血清纯化制得；

所述中华鲟LH蛋白标准品为中华鲟重组LHβ蛋白；

所述LH示踪剂为中华鲟重组LHβ蛋白经生物素标记制得；

所述中华鲟重组LHβ蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示：

LRLCEPVNETISAEKEECPKCLLIQTSICSGSCPTKDPVFKSALSTVQQHVCTYKDLRFVTVTLPDCPPGVDPHFTFPLALSCECSLCRMESSDCTIQSVGPSDCMSGELAIQNY。

2.根据权利要求1所述的一种竞争型中华鲟促黄体生成素检测试剂盒，其特征在于，

所述中华鲟重组LHβ蛋白的制备方法为：

(1)提取中华鲟垂体mRNA，反转录为cDNA，PCR扩增LHβ亚基ORF区序列，双酶切得LHβ双酶切产物；

(2)双酶切表达载体pET-28a+；

(3)将LHβ双酶切产物与双酶切后的pET-28a+表达载体进行连接，得原核表达重组质粒pET-28a+-LHβ；

(4)将原核表达重组质粒pET-28a+-LHβ转化BL21感受态细胞，经诱导表达、纯化获得中华鲟重组LHβ蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种竞争型中华鲟促黄体生成素检测试剂盒，其特征在于，

步骤(1)中，

PCR上游引物：5’-CCGGAATTCCTGCGCCTGTGTGAGCCGGTGA-3’，如SEQ ID NO.1所示；

PCR下游引物：5’-CCGCTCGAGTCAGTAGTTCTGTATGGCGAGC-3’，如SEQ ID NO.2所示；

PCR反应程序：

94℃预变性5min；

94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；

72℃延伸5min；

步骤(2)(3)中，

所述双酶切使用限制性内切酶EcoR I和Xho I；

步骤(4)中，

所述诱导表达条件为：28℃，0.5mM IPTG终浓度诱导表达8h。

4.根据权利要求1所述的一种竞争型中华鲟促黄体生成素检测试剂盒，其特征在于，

所述中华鲟LH抗体的制备方法：

1)将纯化的中华鲟重组LHβ蛋白用PBS稀释，再与弗氏佐剂混匀乳化，对家兔进行免疫，免疫完毕后，得兔抗LHβ多克隆抗血清；

2)利用蛋白A/G纯化法对兔抗LHβ多克隆抗血清进行纯化获得中华鲟LH抗体；

所述中华鲟LH抗体储存浓度为2mg/mL。

5.根据权利要求1所述的一种竞争型中华鲟促黄体生成素检测试剂盒，其特征在于，

所述中华鲟LH蛋白标准品使用时的浓度为500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.6ng/mL、7.8ng/mL、3.9ng/mL、1.95ng/mL、0.975ng/mL、0ng/mL。

6.根据权利要求1所述的一种竞争型中华鲟促黄体生成素检测试剂盒，其特征在于，

所述LH示踪剂的制备方法：

将中华鲟重组LHβ蛋白与9mM的生物素按200μg：200μL比例混合均匀，再置于冰中2h，使用脱盐柱进行纯化；

所述LH示踪剂储存浓度为2mg/mL。