[发明专利]猪圆环病毒3型病毒样颗粒、亚单位疫苗及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种稳定表达猪圆环病毒3型病毒样颗粒的细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1.合成表达猪圆环病毒3型Cap蛋白变体的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1、或SEQID NO.2、或SEQ ID NO.3所示；

步骤S2.将SEQ ID NO.1、或SEQ ID NO.2、或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列经EcoRI和XbaI酶切，再用T4连接酶连接到载体pHBLV-EF1-MCS-CMV-ZsGreen-T2A-PURO上，分别构建用于表达猪圆环病毒3型Cap蛋白变体的重组慢病毒转移质粒pHBLV-PCV3cap-1、或pHBLV-PCV3cap-2或pHBLV-PCV3cap-3，或将SEQ ID NO.1、或SEQ ID NO.2、或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列经EcoRI和XbaI酶切，再用T4连接酶连接到载体pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3Flag上，分别构建用于表达猪圆环病毒3型Cap蛋白变体的重组慢病毒转移质粒pLenti-PCV3cap-1、或pLenti-PCV3cap-2、或pLenti-PCV3cap-3，然后将构建好的转移质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞，收取细胞上清即为重组慢病毒，接着将包装好的重组慢病毒感染CHO细胞，通过嘌呤霉素初步筛选出整合了目的基因的阳性细胞株；

步骤S3.将初步筛选到的阳性细胞株，用流式分选细胞仪进一步筛选，以提高阳性细胞率；

步骤S4.将流式分选后的细胞铺96孔板进行培养，表达猪圆环病毒3型Cap蛋白变体，检测各阳性细胞株的所述蛋白变体的表达量，筛选出阳性且蛋白变体表达量大于阈值的候选细胞株，对筛选出的候选细胞株进行克隆，根据克隆细胞株表达的所述蛋白变体的表达量，挑选出蛋白变体表达量大于阈值的克隆细胞株，进行至少两轮亚克隆，若后一轮的亚克隆细胞株的蛋白表达量相对前一轮不减少、或增加幅度大于阈值，则选为优选细胞株。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中重组慢病毒转移质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞的步骤为：共转染4-6h换新鲜培养液，转染48h后收集病毒上清，将收集的上清以0.45μm滤器过滤，于40ml超速离心管中，4℃，72000g离心120min，置换新鲜培养液；转染后72h分别收集病毒上清，将收集的上清以0.45μm滤器过滤，于40ml超速离心管中，4℃，72000g离心120min，用500μL新鲜培养液重悬病毒沉淀，置于-80℃液氮保存。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中将包装好的重组慢病毒感染CHO细胞的步骤包括：感染前一天CHO细胞传代，传代密度为1×10⁶cell/mL，感染当天CHO细胞密度为1.5～2×10⁶cell/mL，感染时加入适量的包装好的重组慢病毒液，轻轻吹打混匀5-10下，室温放置不超过30min，间隔10min再吹打一次，然后将混合好的病毒液吸出转入培养瓶中，继续病毒感染过夜后换液。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，表达所述猪圆环病毒3型Cap蛋白变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述载体为pHBLV-EF1-MCS-CMV-ZsGreen-T2A-PURO，所述重组慢病毒转移质粒为pHBLV-PCV3cap-1。

5.猪圆环病毒3型病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，其步骤为：将权利要求1所述的优选细胞株扩大培养，培养结束后收集上清，之后用Ni-NTA柱纯化。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述优选细胞株扩大培养的条件为：37℃、5％二氧化碳、130rpm/min、连续培养14天，期间补料2次。

7.猪圆环病毒3型亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗包含按照权利要求5或6所述方法制备的病毒样颗粒。