[发明专利]无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pCXa-vp6-pfc-S及其制备方法和应用

说明书

本发明属于生物技术领域，提供了无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pCXa‑vp6‑pfc‑S及其制备方法和应用，所述表达载体的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。本发明构建了以表面(S‑anchoring)蛋白为锚定模型的营养互补筛选标记大肠杆菌‑植物乳杆菌无抗锚定表达载体，解决了植物乳杆菌细胞壁厚，外源质粒电转化宿主菌及植物乳杆菌连接产物筛选阳性重组子困难的问题，构建的表达载体pCXa‑vp6‑pfc‑S既能在E.coli6212/Δalr中复制表达，又能在L.plantarumNC8/Δalr中表达，同时将VP6抗原与pfc融合表达，增强其免疫反应。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pCXa-vp6-pfc-S及其制备方法和应用。

背景技术

植物乳酸杆菌属于乳酸杆菌属，是革兰氏阳性、兼性厌氧菌，生长在富含碳水化合物的物质中，如今，植物乳酸杆菌菌株在乳制品工业、营养发酵食品的生产和医疗保健方面中发挥着不可或缺的作用，乳酸菌资源的可利用价值高，具有良好的发展前景。就其有益效果而言，35种乳酸杆菌具有欧洲食品安全局(EFSA)的安全资格认证标准，12种乳酸杆菌被药品监督管理局(FDA)公认为安全(GRAS)状态，经统计乳酸杆菌占经认证有益用途微生物总数的43％。植物乳酸杆菌具有多种生理功能，如控制肠道感染、增加某些食物的营养价值、控制血清胆固醇水平、改善乳糖代谢、诱导体内特异性及非特异性免疫应答以及抗肿瘤活性等功能，考虑到这些因素，植物乳酸杆菌可能成为在体内或体外生产功能性化合物的理想底盘。此外，植物乳酸杆菌可直接接触肠黏膜，在肠道中存活并且能够稳定定植，使其成为抗原和药物分子的首选载体，以促进黏膜免疫诱导机体产生理想的免疫应答和免疫耐受。乳酸杆菌作为外源基因表达载体的最大优点是它们模拟自然感染，具有固有的佐剂特性，可以口服。

S-层蛋白(S-layer protein)：目前发现植物乳酸杆菌的许多种属都含有S-层蛋白(S-layer protein)，在43-46kDa之间，S-层蛋白表达量高，其启动子的转录效率高，信号肽引导的分泌效率高，被广泛应用于构建高效锚定表达载体或分泌表达载体。源自于乳酸杆菌的S-层蛋白不但具备锚定表达外源蛋白的能力，还具有黏附特性，也可以作为刺激机体产生免疫应答的佐剂。S-层蛋白(S-layer protein)具有单一的蛋白亚单位组成的规则排列的类晶格结构，与大肠杆菌相比，乳酸杆菌仅有一层细胞膜，目的蛋白可在S层蛋白信号肽的引导下直接分泌到细胞外，从而容易获得目的蛋白。用乳酸杆菌作为疫苗载体不仅可使口服的乳酸杆菌刺激产生黏膜及全身免疫反应，提高某些免疫活性因子如IL-2、IFN-α的分泌，而且可携带特异性抗原分子并分泌到肠道，同时也可穿过肠壁进入黏膜下层，进而引起细胞免疫和体液免疫。

VP6蛋白在病毒粒子中含量最多，是病毒最为主要的结构蛋白，位于病毒三层结构的中间层，由基因片段6编码397个氨基酸，约占病毒蛋白的50％，全长基因为1356bp。VP6是重要的表位标志，其具有较高的免疫原性和抗原性，并诱导保护性免疫。Fc受体为对免疫球蛋白Fc部分c末端的受体，它参与调节和执行抗体介导的免疫反应。

Asd-alr表达系统的筛选：植物乳酸杆菌表达载体的调控元件及质粒上都会设计选择带有一个或多个特定的选择性标记基因。常见的非食品级抗性筛选标记基因为红霉素、卡那霉素和氨苄青霉素等抗性基因，选择在加有这些抗生素的培养基里进行抗性筛选。pSIP409系列质粒是植物乳酸杆菌特有的穿梭载体，选取红霉素抗性基因作为筛选标记。然而，在当前多数益生菌产品仍依赖于抗生素选择标记的背景下，导致饲用益生菌制剂具有潜在抗生素基因漂移的风险，即污染养殖(生态)环境的风险。因此，亟待开发出高效、无毒副作用、适用于人和动物的食品级乳酸杆菌表达载体。

发明内容

本发明的目的在于提供无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pCXa-vp6-pfc-S及其制备方法和应用，所述表达载体pCXa-vp6-pfc-S既能在E.coli 6212/Δalr中复制表达，又能在L.plantarum NC8/Δalr中表达，同时将VP6抗原与pfc融合表达，增强其免疫反应。