[发明专利]雪胆细胞色素氧化酶基因及其转基因工程菌在制备葫芦素中间体中的应用

权利要求书

1.一种雪胆细胞色素氧化酶HcCYP87D20和HcCYP81Q59基因在制备葫芦素中间体中的应用。

2.一种雪胆细胞色素氧化酶HcCYP87D20和HcCYP81Q59基因的转基因工程菌在制备葫芦素中间体中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述HcCYP87D20和HcCYP81Q59基因鉴定方法包括以下步骤：

(1)HcCYP87D20和HcCYP81Q59候选基因筛选；基于雪胆转录组Unigene基本功能注释信息，在测序注释结果中进行筛选CYP450候选基因，且以葫芦科植物中鉴定催化葫芦二烯醇的C11酮基、C20和C2位羟基CYP450，分析发现1个同源基因连续催化葫芦二稀醇C11酮基和C20的CYP87D20基因以及催化C 2位的CYP81Q59基因，最后根据Unigene所对应ID号，从fasta文件中提取Unigene核苷酸序列进行后续分析；

(2)RNA提取和cDNA模板的制备；取雪胆块茎的鲜样，切片后液氮速冻，进行RNA提取，提取的RNA经检测合格后，使用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，保存备用；

(3)基因扩增及回收；基因扩增目的片段为候选基因HcCYP87D20和HcCYP81Q59的开放阅读框，使用上述制备的cDNA进行基因扩增，然后进行跑胶，确认扩增成功后进行目的条带回收。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述基因扩增反应程序为98℃、3min；98℃、30S，58℃、55S，72℃、1min，35个循环；72℃、10min。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的转基因工程菌构建方法包括以下步骤：

(1)将酿酒酵母宿主菌转接到SC-L液体培养基中进行活化，得酵母菌液；

(2)将所述酵母菌液转接到SC-L液体培养基中培养，收集酵母菌体；

(3)取去离子水重悬所述酵母菌体，离心，得酵母沉淀；

(4)向所述酵母沉淀中加入酵母转化体系，混匀，静置，热激，涂板，培养。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述步骤(1)中活化的条件为30℃、220rpm培养24h；所述SC-L液体培养基中培养的方法为：初始OD600为0.4，于30℃摇床220rpm培养至OD600达到0.8～0.9；所述步骤(4)中酵母转化体系包括以下组分：PEG4000溶液、LiAc溶液、sSDNA、重组质粒和灭菌去离子水；所述静置时间为20min；所述热激的条件为在42℃的条件下保持40min。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述重组质粒的构建方法包括以下步骤：

(1)对载体Y33进行线性化，使用SalI酶进行单酶切获得线性化载体，用试剂盒回收，测定载体浓度，备用；

(2)进行同源重组，然后根据插入片段和载体的浓度，计算各组分用量；

(3)将各组分加入到PCR反应管中，按照重组反应体系进行重组操作；所述重组反应体系包括以下组分：线化Y33、插入基因片段、5×CE II Buffer、Exnase II、ddH₂O；

(4)重组质粒提取；吸取测序检测好的阳性单克隆保种液置于LB液体培养基中培养，按照质粒DNA小量制备试剂盒抽提质粒，提取后质粒DNA测定其回收浓度，即得重组质粒。