[发明专利]一种工程改造希瓦氏菌囊泡提高胞外电子传递的方法

说明书

本发明涉及一种工程改造希瓦氏菌囊泡提高胞外电子传递的方法；筛选细胞壁完整性或细胞形态维持相关的目的基因mrdB、mreB、murE、pbpC；针对每个基因设计6个靶向sgRNA，通过Golden gate组装包含sgRNA和dCas9重组质粒；将重组质粒导入希瓦氏菌中，得到24个工程菌株；诱导工程菌的CRISPR‑dCas9转录抑制系统表达，扫描电子显微镜观察囊泡的数量选出每个基因最高效sgRNA对应的工程菌株；将4株工程菌株进行电化学表征，通过诱导CRISPR‑dCas9系统表达促进囊泡分泌，提高其胞外电子传递能力。本发明为改造电活性微生物、促进工业应用提供了新思路。

技术领域：

本发明属于基因工程技术和微生物电化学技术领域，更具体的说是利用合成生物学手段，通过CRISPR-dCas9技术，强化希瓦氏菌ShewanellaoneidensisMR-1的囊泡分泌，从而强化其在微生物燃料电池中的胞外电子传递速率。

背景技术：

微生物胞外电子传递(Extracellular Electron Transfer,EET)是微生物胞内代谢过程产生的电子通过连接细胞内外的导电组件，穿过绝缘细胞膜结构传递至电子受体的过程，常表现为产电微生物将电子从细胞内膜转移至细胞外的金属氧化物或电极等电子受体(electron acceptors)。目前产电微生物和电极间主要有2种胞间电子转移机制得到人们的广泛认可，分别是基于细胞色素蛋白或导电纳米线介导的直接电子传递和基于可溶性氧化还原活性分子介导的间接电子传递。其中，直接电子传递是指产电微生物在电极表面形成生物膜后，通过自身的多血红素导电色素蛋白或导电纳米线实现微生物与电极间的直接接触导电；间接电子传递是指产电微生物通过自身分泌或环境中存在的黄素类、吩嗪类、醌类等氧化还原电子传递载体，在微生物与电极间来回穿梭，通过氧化还原循环，实现间接电子传递。

希瓦氏菌是目前研究最广泛的模式产电菌，为革兰氏阴性菌，大部分属于弧菌科，γ-变形菌门。其长度一般为2-3μm，直径为0.4-0.7μm，是一种棒状杆菌，其最显著的特征是可以利用各种终端电子受体进行厌氧呼吸。在直接电子传递方面，奥达奈希瓦氏菌MR-1主要通过金属还原途径MtrCAB将电子由胞内传递到胞外。经中心碳代谢生成的电子首先以NADH的形式存储在细胞内部，经NADH脱氢酶传递到细胞内膜的甲基萘醌池后，细胞内膜上的c型细胞色素CymA在细胞内膜上氧化氢醌，将所得电子直接传递给MtrA或通过周质空间色素FccA和STC间接传递给MtrA，从而跨过周质空间。随后经过外膜“色素-孔蛋白复合体”MtrCAB传递到胞外电子受体。在间接电子传递方面，MR-1主要靠分泌核黄素(Riboflavin,RF)和黄素核苷酸(Flavinmononucleotide，FMN)电子传递体以“单或双电子氧化还原反应”实现高效产电。早期研究认为，作为电子载体的黄素可以参与一个二电子反应，从外膜色素处得电子变成还原态，还原态的黄素携带电子至电极，在电极上释放电子变成氧化态黄素之后，再重返细胞色素处重新接收电子，以此往复实现电子传递。但近期研究表明，黄素类化合物也可以与导电色素蛋白结合形成半醌类物质，黄素作为色素蛋白的辅因子，以“单电子氧化还原反应”实现产电菌与电子受体之间的电子传递。比如，作为辅因子，核黄素绑定外膜色素蛋白OmcA，黄素单核苷酸绑定MtrC，均形成黄素-细胞色素复合物，彼此协作共同运输两个电子。