[发明专利]一种工程改造希瓦氏菌囊泡提高胞外电子传递的方法

权利要求书

1.一种工程改造希瓦氏菌囊泡提高胞外电子传递的方法；其特征是：包括如下步骤：

(1)筛选模式产电微生物希瓦氏菌Shewanella oneidensis MR-1基因组上有利于囊泡分泌的相关基因，得到参与细胞壁完整性基因murE、pbpC和维持细胞形态维持的基因mrdB、mreB；

(2)针对4个目的基因mrdB、mreB、murE、pbpC，每个基因分别设计构建6个靶向sgRNA及其上、下游引物；

(3)通过Golden gate技术分别将不同的sgRNA序列整合到具有dCas9蛋白、IPTG诱导型P_tac启动子和卡那抗生素抗性的原始基础质粒pHG11-dCas9上，得到24个包含sgRNA和dCas9的重组质粒；

(4)将步骤(3)构建的24个重组质粒分别热激化转至2,6-二氨基庚二酸(DAP)营养缺陷型大肠杆菌感受态WM3064中并抗性筛选；

(5)将步骤(4)抗性筛选得到的含有重组质粒的大肠杆菌WM3064与野生希瓦氏菌进行接合转移，将大肠杆菌中的重组质粒导入野生希瓦氏菌中，构建24株工程希瓦氏菌株；

(6)诱导步骤(5)构建的24株工程希瓦氏菌株CRISPR-dCas9系统的表达，对每个目的基因进行转录抑制，并通过扫描电子显微镜观察囊泡的数量，筛选出每个目的基因的最高效sgRNA对应的工程菌株MrdB6、MreB4、MurE5、PbpC2；

(7)基于步骤(6)筛选得到的4株工程菌株的二级发酵液和铁氰化钾溶液，分别构建双室微生物燃料电池并进行电化学表征，通过诱导CRISPR-dCas9系统表达，对靶基因的转录抑制从而促进囊泡分泌，提高其胞外电子传递能力。

2.如权利要求1所述的方法；其特征是：步骤(1)筛选出的基因mrdB的序列为SEQ IDNO.1；基因mreB的序列为SEQ ID NO.2；基因murE的序列为SEQ ID NO.3；基因pbpC的序列为SEQ ID NO.4。

3.如权利要求1所述的方法；其特征是：步骤(3)涉及的原始基础质粒pHG11-dCas9的序列为SEQ ID NO.5。

4.如权利要求1所述的方法；其特征是：步骤(6)筛选得到的4个目的基因最高效sgRNA对应的工程菌株MrdB6含有的重组质粒序列为SEQ ID NO.6；工程菌株MreB4含有的重组质粒序列为SEQ ID NO.7；工程菌株MurE5含有的重组质粒序列为SEQ ID NO.8；工程菌株PbpC2含有的重组质粒序列为SEQ ID NO.9。

5.如权利要求1所述的方法；其特征是：步骤(7)所述二级发酵液制备方法是：将一级种子液以1％的接种量接种到装有100mL的含0.1mM IPTG、50mg/L卡那抗生素的LB液体培养基的250mL锥形瓶中，在30℃、200rpm摇床过夜扩大培养，得到二级发酵液。

6.如权利要求1所述的方法；其特征是：步骤(7)高产囊泡的重组菌株在得到的发酵液作为阳极微生物催化剂，按OD₆₀₀＝0.5接种到微生物燃料电池的阳极室，阴极室接种传统的K₃[Fe(CN)₆]溶液作为阴极电子受体，实现高电能输出。