[发明专利]一种低密度脂蛋白低速离心分离纯化方法

说明书

本发明涉及一种低密度脂蛋白低速离心分离纯化方法，包括以下步骤：以人血清、血浆和提取了其他蛋白后剩余的血浆下脚为原料，加PEG6000沉淀血浆低密度脂蛋白，再加NaCl调节液体密度并离心，反复此过程，逐步改变PEG6000和NaCl的浓度和配比直至血浆低密度脂蛋白沉淀在离心后漂浮在液体表面从而与其它蛋白质分离。本发明具有操作简便，处理容量大，试剂易得价廉且安全，器材要求低，得率较高，为血浆低密度脂蛋白的各种研究提供了一个便利条件。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体地说，涉及一种低密度脂蛋白低速离心分离纯化方法。

背景技术

血浆低密度脂蛋白(lipoprotein,LDL)是由一系列大小、密度和化学组成各异的颗粒组成，具有异质性，以胆固醇酯和三酰甘油为核心，磷脂、自由胆固醇和1个ApoB-100为外壳的球状蛋白质。LDL一直是血脂与心血管疾病的研究重点，但高要求的分离提纯方法使许多临床工作者的研究因不能获取纯LDL而只能停留在统计临床数据，很可惜不能进入结构与功能研究的层次。另外目前极少见到LDL作为生物制剂的研究报告，作为血液中正常成分，LDL应该有它的应用价值。上世纪20年代后期，有人提出体内脂质是与蛋白相结合的，后来的研究一直不断，并有了α脂蛋白和β脂蛋白的分类命名，在1948年产生了用超速离心机根据密度分离脂蛋白的方法，同时对脂蛋白与相关疾病的研究也开始了蓬勃发展。到目前为止，脂蛋白的纯化方法主要用超速离心，也有些用层析和亲和层析等方法，均存在设备或材料要求高、处理量小或周期长等问题。提纯电泳对于百毫克级的蛋白分离很有效，克级的装置也早已出现，但电泳法需要对材料进行预处理，达到一定的纯度后效果才好，且对克级以上的规模要求有些力不从心。

中国专利文献CN109323910A，公开日2019.02.12，公开了一种高纯度低密度脂蛋白的制备方法，根据密度不同离心去除血浆中的乳糜微粒、极低密度脂蛋白，提取剩余的血浆加入溴化钾调密度为1.045g/mL，再进行离心得到位于最上层的常规低密度脂蛋白，使用磷酸缓冲盐溶液透析降低K⁺浓度，低密度脂蛋白透析前后K⁺浓度的全自动生化分析仪所测结果与渗透压仪检测结果相比较，如透析至与磷酸缓冲盐溶液渗透压无明显差异，则认为溴化钾被完全透析，进而获取高纯度低密度脂蛋白。中国专利文献CN109580303A，公开日2019.04.05，公开了一种低密度脂蛋白的制备方法，包括如下步骤：向血清中加入大分子化合物，除去低密度脂蛋白和高密度脂蛋白以外的血清脂蛋白；然后用金属离子沉淀低密度脂蛋白；再用缓冲液和金属离子溶解沉淀，并去除白蛋白等少量杂质蛋白，最后进行低密度脂蛋白的纯化。文献(王克勤,陈玉芳,冉碧芳,脂蛋白的研究I.人血清β脂蛋白的大量分离的新方法及其某些性质研究ActaBiochimica etBiophysica Sinica 1964(03):13-24)中很久以前就对规模化提取LDL作了研究，相比超速离心法提取量大大提高，但还是需要高速离心机，操作要保持低温。低温乙醇法则可以达到较大规模，但面临有机溶剂也许会影响脂蛋白结构的情况，且要始终将温度控制在一定范围内，操作颇为不便。上述脂蛋白分离纯化的操作的法多种多样，归纳下来有超速离心法、各种沉淀法、各种层析法等，组合这些方法达到纯化的目的，对这些方法从时间、仪器设备要求、操作步骤简繁程度、规模和最终得率等方面看并不尽如人意。本发明采用低速离心机和廉价无毒的化学试剂从各种人血浆或血清及其他体液中分离纯化人的低密度脂蛋白，也可从提取完其他蛋白的血浆下脚料中提取。这是一个运用新的思路发明的原创的纯化脂蛋白方法，目前尚未见到相似的报道。

发明内容

本发明的目的是，针对现有技术中的不足，提供一种低密度脂蛋白低速离心分离纯化方法。

本发明是通过如下方案实现的：

以人血清、血浆和提取了其他蛋白后剩余的血浆下脚为原料，加PEG 6000沉淀LDL，加NaCl调节液体密度并离心，反复此过程，逐步改变PEG 6000和NaCl的浓度和配比直至LDL沉淀在离心后漂浮在液体表面从而与其它蛋白质分离，具体包括一下步骤：