[发明专利]非洲猪瘟病毒pK205R蛋白的哺乳动物细胞表达、单克隆抗体制备、表位鉴定及应用

说明书

本发明涉及一株针对ASFVK205R编码蛋白的哺乳动物293i细胞表达、单克隆抗体制备、表位鉴定及应用。通过构建真核表达载体pCDNA3.4‑K205R‑strep,瞬时转染293i细胞表达重组pK205R蛋白，纯化后免疫Balb/c小鼠，经过四次免疫后取小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合制备杂交瘤细胞，然后利用间接ELISA方法进行亚克隆获得抗pK205R蛋白的单克隆抗体，并确定该抗体所对应的抗原表位为²VEPREQFFQDLLSAV¹⁶。

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体提供了一种猪非洲猪瘟病毒pK205R蛋白的293i细胞表达、单克隆抗体制备、表位鉴定及应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)自2018年传入我国以来，给养猪业带来了惨重的经济损失。目前，仍没有商业化疫苗用于该病的防控。非洲猪瘟病毒(African swinefever virus，ASFV)作为该病病原，是一种有囊膜的DNA病毒，病毒粒子呈二十面体结构，基因组大小约为170～190kb，可以编码至少200种病毒蛋白。其中，与基因组复制、病毒组装、免疫逃逸、致病传播相关的蛋白常被关注，例如p30、p54、p72、p17、pB602L、pK205R等。ASFVK205R编码序列在毒株之间高度保守，pK205R蛋白的早期弥漫性表达后期与病毒粒子的形成紧密联系，参与细胞重组以形成病毒工厂。pK205R蛋白作为主要抗原蛋白之一，它的反应原性较强，且是ASFV早期表达的抗原蛋白，故pK205R蛋白可作为ASFV早期检测的指标，对ASFV早期诊断意义重大。

目前，有关ASFV K205R编码蛋白的功能研究和抗原表位的报道还很欠缺。本发明利用细胞融合及亚克隆筛选，成功制备一株针对ASFVK205R编码蛋白的单克隆抗体，并对其识别的抗原表位进行了鉴定，发现其特异性识别ASFV pK205R蛋白2－16肽段，序列为²VEPREQFFQDLLSAV¹⁶。利用软件分析证实，该肽段序列在不同ASFV毒株中保守。本发明不仅为疫苗研发提供了基础知识，且具有确定表位的诊断潜力，并通过试验证实该单克隆抗体具有很强的特异性，为ASF疫苗的攻关和高灵敏度检测方法的建立奠定了良好的基础。

哺乳动物细胞目前是一种表达外源蛋白的热门系统，被广泛应用于各种生物制品的研发中，比如单克隆抗体、干扰素、生长因子、病毒抗原的稳定表达与纯化。与原核表达系统相比，哺乳动物细胞系统表达系统具有高效、准确的翻译后修饰功能，其表达的重组蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白。同时，利用无血清、化学成分清晰的培养基悬浮培养哺乳动物细胞后，外源蛋白表达水平进一步提高，有利于纯化，可进行大规模生产。本发明利用293i细胞悬浮系统表达并纯化ASFV K205R编码蛋白，制备特异性单克隆抗体，鉴定其识别的特异性抗原表位，并建立了针对ASFV pK205R抗体的间接ELISA方法，为开展ASFV pK205R蛋白功能研究和诊断试剂研发提供给了基础。

发明内容

针对现有技术存在的空白，本发明提供了一种ASFV K205R编码蛋白的表达纯化、单克隆抗体制备、鉴定方法及其相关应用。本发明的技术方案是：将ASFV K205R基因序列克隆到pcDNA3.4载体中构建真核表达载体，瞬时转染293i哺乳动物细胞悬浮表达系统，通过下游strep标签进行蛋白纯化，将纯化后的pK205R蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0细胞进行融合，制备杂交瘤细胞，用纯化的pK205R蛋白包被ELISA反应板，通过间接ELISA方法筛选能够特异性识pK205R蛋白的阳性杂交瘤细胞，并鉴定其识别的抗原表位。