[发明专利]一种Cas12a变体及其在基因编辑中的应用

说明书

本发明提供了一种Cas12a变体及其在基因编辑中的应用，所述Cas12a变体为LbCas12a‑K538R，氨基酸序列如SED ID NO.2所示。本发明首次通过蛋白改造，获得Cas12a变体，使Cas12a的PAM识别相比较对应野生型更严格，从而降低脱靶效应；所述三种Cas12a变体能够在crRNA的介导下定点对真核生物基因组进行基因编辑且具有更低的脱靶效应，三种Cas12a变体的发现进一步扩大了基因编辑工具的种类。

本发明专利申请是申请号为“CN202110578385.X”的发明专利的分案申请，原申请的申请日为“2021年5月26日”，申请号为“CN202110578385.X”，发明名称为“一种Cas12a变体及其在基因编辑中的应用”。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，特别涉及一种Cas12a变体及其在基因编辑中的应用。

背景技术

自2013年以来，基因编辑技术取得了突破性进展，此项技术已经在基础科学研究、医药、临床、生物技术等许多领域引起了新的变革。除了具有代表性的Cas9系统之外，Cas12，又名Cpf1，作为又一种被发现的具有基因编辑效应的CRISPR系统新成员，极大的扩大了基因编辑系统靶点的可编辑范围，相比于Cas9系统，Cas12a所具有的加工前提RNA的功能，为其介导多基因编辑提供了相比与Cas9系统更为便捷高效的编辑能力。除此之外，相比于Cas9的向导RNA，Cas12a的向导RNA组成更为简单，设计更为方便。

2015年，张峰团队首次发现了Cas9系统之外的另外一种具有基因编辑能力的新成员，Cas12a，又名Cpf1，将其划分到CRISPR系统2类V型中。相比于Cas9系统，Cas12a的编辑效率与Cas9的效率相当，在有些靶点低于Cas9。Cas12a的脱靶率极低，相比于Cas9脱靶率高的特性，Cas12a是一种安全的基因编辑工具。Cas12a在切割之后形成粘性末端，而Cas9形成平末端，已有研究表明，Cas12a切割之后的粘性末端相比于Cas9的平末端而言，更容易发生同源重组修复，这也为基因的定点插入和修复提供了更好的工具。在向导RNA的加工方面，Cas12a具有明显的优势，仅仅只需要Cas12a本身就能够完成对前提RNA的加工，而Cas9系统则需要RNaseIII的加工，这极大地促进Cas12a在多基因编辑上的应用。在PAM的识别上，Cas12a识别5’-TTTN-3’或5’-KYTV-3’，Cas9则识别5’-NGG-3’。

因此，Cas12a作为一种新型基因编辑工具，与Cas9系统一道，为科学研究和疾病的治疗提供了有力的工具。基于对目前已有的Cas12a的研究，为应对将来各种情况下的基因编辑事件，发现更多的具有一定特性的Cas12a变体是一件具有重要意义的事情。

发明内容

本发明目的是提供一种Cas12a变体及其在基因编辑中的应用，该Cas12a变体包括Lb2Cas12a-K518R，LbCas12a-K538R，AsCas12a-K548R，其在体外比对应野生型PAM识别更严格；且在体内脱靶效应更低。

在本发明的第一方面，提供了一种Cas12a变体，所述Cas12a变体包括如下中的至少一种：

Lb2Cas12a-K518R，氨基酸序列分别如SED ID NO.1所示；

LbCas12a-K538R，氨基酸序列分别如SED ID NO.2所示；

AsCas12a-K548R，氨基酸序列分别如SED ID NO.3所示。

在本发明的第二方面，提供了一种重组表达载体，所述重组载体表达所述的Cas12a变体。

进一步地，所述重组表达载体包括质粒载体、病毒载体和噬菌体载体中的一种。

在本发明的第三方面，提供了一种重组菌或重组细胞系或重组病毒，包含所述的重组表达载体。