[发明专利]一种免疫细胞冻存液及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种免疫细胞冻存液，包括培养基和添加在培养基中的以下成分：丝素蛋白、汉防己甲素、海藻糖、胰岛素、丙酮酸钠、L‑谷氨酰胺。本发明提供的免疫细胞冻存液中添加丝素蛋白、汉防己甲素等成分协同作用，实现了在‑80℃条件下长期保存免疫细胞，并且经保存的免疫细胞存活率高，杀伤活性不下降。该冻存液不添加DMSO，成分安全。本发明还提供了一种免疫细胞冻存液的制备方法，过程简便易于操作，可将制备的冻存液保存于4℃，需要时恢复至室温即可。本发明还提供了上述免疫细胞冻存液的应用，将待保存的免疫细胞用上述冻存液重悬后程序降温至‑80℃即可，无需液氮即能实现免疫细胞的长期保存，降低了免疫细胞的保存成本。

技术领域

本发明涉及一种冻存液，尤其涉及一种免疫细胞冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞。包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。免疫细胞可以分为多种，在人体中各种免疫细胞担任着重要的角色。

近年来免疫细胞治疗被用在肿瘤、以及各种免疫系统缺陷引起的疾病中。免疫治疗的第一步要先采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力。体外培养的免疫细胞如暂时无需使用，可将培养得到的免疫细胞保存起来，待需要使用是再恢复细胞活性，常见的保存方法是将细胞在液氮中冻存。

细胞冻存是指将细胞放在低温环境(如液氮)，以达到减少细胞代谢的作用，从而达到对细胞进行长期储存进行保种的目的，以供后续实验或临床使用。常用的冻存液通常添加一定比例的二甲基亚砜(DMSO)。DMSO可以减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性，可以在细胞冻存过程中保护细胞。但是DMSO在常温条件下却对细胞有害，若DMSO未清洗干净，对复苏后细胞状态影响较大。使用普通含DMSO的冻存液冻存细胞，复苏后细胞活力显著下降，部分细胞表面抗原会随之丢失，细胞杀伤活性下降。采用液氮冻存多设备要求高，保存成本高，增加患者负担，因此有必要对免疫细胞的冻存液进行研究，进而实现在不添加DMSO，无需液氮保存的情况下使冻存后的免疫细胞保持较好的活性。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种免疫细胞冻存液，不添加DMSO，在-80℃实现免疫细胞的长期保存。

本发明的目的之二在于提供一种免疫细胞冻存液的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种免疫细胞冻存液的应用。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种免疫细胞冻存液，包括培养基和添加在培养基中的以下成分：丝素蛋白、汉防己甲素、海藻糖、胰岛素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺。

进一步地，所述培养基为RPMI-1640培养基，各成分在培养基中的用量为：丝素蛋白8.6-12.5ng/mL、汉防己甲素5.3-9.8ng/mL、海藻糖3.5-7.2μg/mL、胰岛素1.5-4.9μg/mL、丙酮酸钠2.8-5.2ng/mL、L-谷氨酰胺1-5μg/mL。

进一步地，各成分在培养基中的用量为：丝素蛋白10.7ng/mL、汉防己甲素7.5ng/mL、海藻糖5.8μg/mL、胰岛素3μg/mL、丙酮酸钠4.1ng/mL、L-谷氨酰胺2μg/mL。

进一步地，所述丝素蛋白的分子量小于3000Da。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

上述免疫细胞冻存液的制备方法，包括以下过程：向培养基中加入丝素蛋白、汉防己甲素、海藻糖、胰岛素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺混合均匀，在4℃保存备用。

本发明的目的之三采用如下技术方案实现：