[发明专利]生物样本中硫化氢的检测方法及其应用

权利要求书

1.一种生物样本中硫化氢的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括对样本进行前处理，使样本中的硫化氢反应生成亚甲基蓝，然后采用LC-MS检测样本中的亚甲基蓝，将LC-MS检测获得的亚甲基蓝检测值带入标准曲线中，计算得到亚甲基蓝对应的硫化氢的含量；

所述前处理包括使用提取试剂与样本中的硫化氢反应，得到含有硫化锌的沉淀，然后在酸性介质中和三价铁离子存在的条件下，与N,N-二甲基对苯二胺反应，生成亚甲基蓝；

所述提取试剂为氢氧化锌悬浊液。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述氢氧化锌悬浊液为乙酸锌溶液和氢氧化钠溶液混合后得到的悬浊液；

优选地，乙酸锌溶液的浓度为1～2％w/v；氢氧化钠溶液的浓度为1～2M；乙酸锌溶液和氢氧化钠溶液的体积比为(5～10):1；

优选地，乙酸锌溶液的浓度为1％w/v；氢氧化钠溶液的浓度为1.5M；乙酸锌溶液和氢氧化钠溶液的体积比为7:1。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述反应试剂为三氯化铁反应液和二甲基对苯二胺反应液混合得到的混合体系，且所述混合体系的使用方式为现用现混合；

优选地，三氯化铁反应液中三氯化铁的浓度为20～50mM，溶剂为浓盐酸和水的混合体系，其中水和浓盐酸的体积比为(8～10):1；

优选地，三氯化铁反应液中三氯化铁的浓度为30mM，溶剂为浓盐酸和水的混合体系，其中水和浓盐酸的体积比为9:1；

优选地，N,N-二甲基对苯二胺反应液中N,N-二甲基对苯二胺的浓度为15～25mM，其中水和浓盐酸的体积比为4:(5～8)；

优选地，N,N-二甲基对苯二胺反应液中N,N-二甲基对苯二胺的浓度为20mM，其中水和浓盐酸的体积比为4:6。

4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，所述前处理包括：调节样本pH为9以上，再加入所述提取试剂混合均匀并超声，固液分离后留取沉淀并将沉淀复溶，再在酸性介质中和三价铁离子存在的条件下，与N,N-二甲基对苯二胺反应，生成亚甲基蓝。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述标准曲线按照如下方法构建：

用于构建标准曲线的标准品为包括具有系列浓度的硫化钠标准曲线工作液，将各浓度的硫化钠标准曲线工作液分别与所述反应试剂反应生成亚甲基蓝，然后使用LC-MS检测硫化钠标准曲线工作液中的亚甲基蓝，得到检测值；然后构建亚甲基蓝检测值与对应的硫化钠标准曲线工作液中硫化钠的浓度的对应关系作为标准曲线；

优选地，所述硫化钠标准曲线工作液中硫化钠的浓度分布范围为0.78μM～100μM；

优选地，所述标准曲线以硫化钠标准曲线工作液中硫化钠的浓度为自变量，以亚甲基蓝响应峰面积为因变量，构建标准曲线；

优选地，所述硫化钠标准曲线工作液中的基质为保护液，所述保护液为含有金属螯合剂的碱性溶液；

优选地，所述金属螯合剂选自EDTA；

优选地，所述保护液为含有50μM EDTA和200mM氢氧化钠的水溶液；

优选地，所述标准曲线为y＝30.208678x+4938.01，其中横坐标X为亚甲基蓝的浓度；纵坐标Y为亚甲基蓝响应峰面积。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，液相色谱色谱柱采用氨基色谱柱，优选采用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱；

优选地，柱温为35～45℃，优选为40℃；

优选地，检测环境温度为不超过20℃，优选为4℃；

优选地，进样体积为1～2μL，优选为1μL。