[发明专利]一种基于MADLI-TOF MS直接鉴定菌液中克罗诺杆菌的方法

说明书

一种基于MADLI‑TOF MS直接鉴定菌液中克罗诺杆菌的方法，属于食源性致病菌鉴定技术领域。为了解决现有技术利用MALDI‑TOF MS鉴定克罗诺杆菌均采用固体点样方式，易造成鉴定结果的误差，需要多菌落形成单元的技术问题，本发明提供了一种基于MADLI‑TOF MS直接鉴定菌液中克罗诺杆菌的方法，该方法将生长至对数期的菌液离心获得菌泥，添加甲酸溶液进行超声处理，然后添加乙腈混匀，离心后的上清作为前处理点样液进行MADLI‑TOF MS检测。该方法可避免传统MALDI‑TOF MS固体点样方法所造成的重复性差、无法定量、适用性差的问题，可应用于多种来源的阪崎克罗诺杆菌鉴定。

技术领域

本发明属于食源性致病菌鉴定技术领域，具体涉及一种基于MADLI-TOF MS直接鉴定菌液中克罗诺杆菌的方法。

背景技术

食源性致病菌因其有着高致病能力及环境耐受性是一类受到人类关注的微生物。其中，阪崎克罗诺杆菌由于其对于婴儿的易感性和高致死率，更受到婴幼儿配方行业的关注。但多年以来，阪崎克罗诺杆菌污染婴幼儿配方乳粉事件仍在全世界范围内层出不穷且从未间断。亟待开发快速可靠的检测手段对婴幼儿配方乳粉(PIF)加工环境以及终产品中阪崎克罗诺杆菌进行监测。

传统致病菌检测手段诸如生化、比色的以及酶联免疫吸附技术因其操作繁琐、时效性差以及需要专业人士操作等多种问题受到限制。该些方法对于致病菌的检测亦受限于难以区分相似度较高的致病菌的种和属，或是难以培养的微生物。

基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)作为一种新兴技术。由于其性价比较高、时效性强、高通量的优势而被广泛用于致病微生物的鉴定以及靶向抗生素治疗。尽管如此，MALDI-TOF MS目前对于微生物的鉴定多见于挑取固体培养基中单菌落进行鉴定，由于不同类别微生物形态大小存在差异，会导致固体点样难度的提升；亦有可能由于固体点样方式前处理裂解效果较差，难以获得胞内核糖体蛋白信息的缺失，从而造成鉴定结果的误差。虽然在某些研究中使用MALDI-TOF MS与前处理操作相结合，对液体培养基培养的微生物进行鉴定，但仍多以挑取细菌菌泥进行点样，且需要超过10菌落形成单元/mL，并不能称为液体直接点样方式。因此，亟需一种直接鉴定菌液中克罗诺杆菌的方法。

发明内容

为了解决现有技术利用MALDI-TOF MS鉴定克罗诺杆菌均采用固体点样方式，易造成鉴定结果的误差，需要多菌落形成单元的技术问题，本发明提供了一种基于MADLI-TOFMS直接鉴定菌液中克罗诺杆菌的方法，包括如下步骤：

S1、将待测菌液培养至对数期，对菌液进行离心处理，收集下层菌泥，使用质量分数为0.85％的NaCl溶液重悬菌泥，去除胞外代谢物，保持菌体完整性，离心弃上清，获得下层菌泥，再次使用质量分数为0.85％的NaCl溶液重悬菌泥，离心后获得下层菌泥；

S2、向S1获得的菌泥中加入体积分数为70％的甲酸溶液，进行超声处理；

S3、加入乙腈溶液，涡旋混合后获得前处理液体；

S4、对前处理液体进行离心，取上清液，得到前处理点样液备用；

S5、利用MADLI-TOF MS仪器对前处理点样液进行鉴定，将采集到的谱图数据导入QuanID DB数据库进行比对，通过对比质荷比和特征峰得到鉴定结果。

进一步地限定，S1所述对数期的菌体浓度为10⁸CFU/mL。

进一步地限定，S1所述离心条件为12000rpm，2min。

进一步地限定，S2所述甲酸的添加量为20μL。

进一步地限定，S2所述超声的功率为300W。

进一步地限定，S2所述超声的时间为2min。

进一步地限定，S3所述乙腈的添加量为75μL。