[发明专利]一种AAV空壳率的液相色谱分析方法

说明书

本发明公开了一种AAV空壳率的液相色谱分析方法，所述分析方法包括以下步骤：1）阴离子色谱柱的选择；2）色谱条件设置并进行上样和洗脱；3）检测：UV检测器和荧光检测器对AAV空壳率进行分析。本发明的Sepax Proteomix POR‑Q色谱柱在测定不同血清型AAV的空壳率方面表现出了强大的能力，峰分辨率较其他类型的阴离子交换柱显著高很多。本发明的液相色谱分析方法使用简便，AAV的空壳和实心可以达到基线分离，并且该方法经简单的梯度调整，可适用于多种血清型AAV空壳率的分析。

技术领域

本发明属于生物大分子表征分析技术领域，涉及一种AAV空壳率的液相色谱分析方法。

背景技术

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体由二十面体样的衣壳及其包裹着的单链转基因DNA组成。在AAV载体组装过程中，会产生三种衣壳：完整衣壳(fullcapsid)、部分衣壳(partial capsid)，和空衣壳(empty capsid)。完整衣壳也称实心AAV，它包含正确的DNA序列，是人们所需要的产品；部分衣壳和空衣壳(也称空心AAV)则属于生产中的杂质，可能会存在以下几种危害：1)影响产品的纯度，2)增加最终产品的免疫原性，3)会与完整衣壳竞争感染细胞上的载体结合受体，从而抑制完整衣壳的转导，增加总体病毒载量。部分衣壳与空衣壳的存在严重地影响了AAV产品的安全性和有效性，因此在整个生产过程中监控空/完整衣壳比(空壳率)是很有必要的。

目前，测定AAV空壳率的方法主要包括透射电镜(Transmission ElectronMicroscopy，TEM)、阴离子交换色谱法(Anion-Exchange Chromatography，AEC)、分析超速离心技术(Analytical UltraCentrifugation，AUC)，以及qPCR、酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)、光密度法(Optical Density，OD)等。每种方法都利用一种独特的方法来处理进而得到AAV空壳比率。然而，这些方法也存在自身的局限性。

其中，透射电镜(Transmission ElectronMicroscopy，TEM)是比较常用的测定空壳率的参考方法，但其样品中的蛋白质和细胞碎片会干扰TEM图像中AAV衣壳的准确识别，并且依赖于人工视觉识别进行量化，颗粒部分填充以及染色不均匀也会导致无法清晰识别各类衣壳亚种。

分析型超速离心技术(Analytical Ultracentrifugation，AUC)也是较常用的一种测定空壳率的方法。其依据高速离心作用实现分离，适用于很多实验室。但其操作烦琐耗时，不利于载体的大规模纯化；并且AAV载体长期在超速离心的强剪切力作用下，可能会导致载体粒子活力降低。